田文静，罗学刚，吕丽慧，倪 萌，井晓兰，张同存

(1.天津科技大学 生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室，天津 300457;2.武汉科技大学医学院，湖北 武汉 430065;3.天津市工业微生物重点实验室，天津 300457)

乳糖诱导瑞替普酶在大肠杆菌中的可溶性表达

田文静1，罗学刚1，吕丽慧1，倪 萌1，井晓兰1，张同存2，3

(1.天津科技大学 生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室，天津 300457;2.武汉科技大学医学院，湖北 武汉 430065;3.天津市工业微生物重点实验室，天津 300457)

目的 构建瑞替普酶(rPA)大肠杆菌基因工程菌，优化乳糖诱导表达条件，并获得活性重组蛋白。方法通过PCR扩增得到rPA编码基因，将该基因片段克隆到载体pET40b中，转化E.coli BL21。优化确定乳糖诱导浓度、时间、温度等参数，将诱导表达后获得的菌体细胞通过超声破碎裂解后利用镍柱亲和色谱进行分离纯化，重组目的蛋白经Xa因子切割去除DsbC融合标签后释放获得rPA产物，最后利用纤维蛋白平板法对其溶栓活性进行检测。结果 rPA重组质粒构建成功，利用终浓度30 mmol/L的乳糖于30℃诱导5 h可以获得很好的表达效果，重组蛋白的表达量、可溶性及酶活与IPTG诱导产物基本接近;经纯化后的rPA目的蛋白可表现出明显的溶栓活性。结论 本研究为进一步利用大肠杆菌系统表达生产高活性重组rPA提供了一定的参考依据。

瑞替普酶;DsbC;乳糖;大肠杆菌;表达

由血管栓塞引发的各类心血管疾病严重威胁人类生命，是造成死亡和病残的主要原因之一。全世界每年心血管病患者多达1 300万，其中急性心肌梗死(AMI)死亡率高达30%。……