王海燕，苏建辉，王子华，詹杰鹏，向本春，黄先忠，郑银英

北疆抗虫棉Bt毒蛋白在棉蚜食物链中的动态研究

王海燕，苏建辉，王子华，詹杰鹏，向本春，黄先忠，郑银英

（石河子大学生命科学院∕石河子大学农业生物技术重点实验室，石河子832003）

利用ELISA法检测了抗虫棉益农二号不同时期叶片中的Bt蛋白的含量，以及棉田中棉蚜和龟纹瓢虫体内Bt蛋白的含量；利用室内Bt棉叶片饲养试验，观测棉蚜和龟纹瓢虫的生命参数。结果表明：抗虫棉真叶中Bt毒蛋白的含量随棉株发育而增加：从三叶期的121 ng／g增加到盛花期的304 ng／g，但子叶的含量高于早期的真叶。相应地，在抗虫棉田中的棉蚜和龟纹瓢虫体内均检测到了Bt毒蛋白的存在。棉蚜体内最高检测到6 ng／g的水平，平均含量2.8～3.7 ng／g；而龟纹瓢虫中Bt的含量高于棉蚜：四龄幼虫平均为8.4 ng／g，雌性成虫体和雄性成虫分别为16.9 ng／g和27.8 ng／g。Bt棉上的棉蚜若虫繁殖力和蜕皮率略高于常规棉，若虫生长历期缩短0.5 d左右；用Bt棉田的棉蚜饲喂的龟纹瓢虫，其生长发育、存活率以及繁殖力等未受到影响。

抗虫棉；Bt毒蛋白；棉蚜；龟纹瓢虫；ELISA

随着转基因工程的快速发展，我国转基因棉花种植面积每年以10%呈持续性增长。据James统计，2009年全球转基因作物种植面积已增长至1.34亿h m2，其中转基因棉花种植面积占49%［1］，据我国农业部最新统计，我国Bt棉的种植面积已经达到380万h m2，约占棉花种植总面积的70%，而新疆Bt棉种植面积却占全国Bt棉的51%。这种种植的快速增长趋势，确实引起了人们对生态环境安全性问题的广泛关注，Bt棉对非靶标生物的影响已成为生态风险评价的焦点之一［2］。直接或间接取食转基因Bt棉后，有可能对植食者或天敌产生一些不良影响，对自然界的生态系统造成一种新的植物－植食者－天敌三者食物链格局奠定了一定的基础。

目前，已有不少关于转Bt基因的植物对非靶标生物和天敌的影响报道［2］，如Bt棉田的生物种群群落的动态趋势或在室内条件下对供试对象的生物学特性的影响，然而Bt杀虫蛋白能否在转基因植物－非靶标植食者－天敌三者间进行传递与富集并未进行深入的探究。

迄今为止，已有报道证实Bt杀虫蛋白在植食者体内的存在与转移［3－5］。对于Bt蛋白的传递过程及其对其他生物的影响非常值得我们深入探究。为此，本文主要通过ELISA（enzy me linking i mmunosor bent assay）法，对新疆北疆地区广泛种植的Bt棉（益农二号）的Bt蛋白的定性定量检测的基础上，进一步研究了Bt蛋白在Bt棉－非靶标害虫－天敌这一食物链中是否存在传递效应以及Bt棉是否对昆虫的生态系统产生影响。

1 材料与方法

1.1 供试棉花品系和种植管理

本实验所用的抗虫棉（Gossypiu m.hirsut u m L.）益农二号（伊陆早16号）购自益农种苗公司。对照棉为新疆北疆地区广泛种植的新陆早33号常规棉。

实验于2010年在石河子大学实验站试验田进行。2010年4月30日播种，种植面积为0.5 h m2，地膜覆盖。各品系播种量：伊陆早16号15 kg／h m2，新棉33号12 kg／h m2（脱绒后的质量）。整个生长期，棉花不使用农药，除防治其他害虫严重时应予以适当喷洒农药，不打顶，不摘边心，其他都为常规管理。

1.2 酶联免疫吸附法

Bt蛋白含量和定性分析按照美国Envir ol ogix公司酶联免疫吸附法的检测试剂盒（Quali Pate T M kit for CryIAb／CryIAc）说明书进行。

本试剂盒包含的试剂：抗体包被的96孔酶标生测板、CryIAb／Cr yIAc阳性对照，CryIAb／Cr yIAc酶连接物及显色底物，1 mol／L HCl的终止液，1 L的PBS缓冲液的试剂包，1倍PBST（磷酸盐，含0.05%吐温－20）缓冲液，6种试剂均在4℃保存。

吐温－20常温保存，抽提缓冲液PBSE（磷酸盐，含0.55%吐温－20），现用现配该试剂盒在植物组织中Bt蛋白最低检测量为0.04 ng／mL F W（鲜重）。

Bt蛋白含量在伯乐公司Model 550酶标仪450 n m波长下测定，测定时以每毫升含有0.375、0.6、0.75、1.5、3.0和6.0 ng纯化蛋白（Cr yIAb／Cr yIAc蛋白标样）做标准曲线（阳性对照），以常规棉品系新棉33号作为阴性对照。样本中Bt毒蛋白的浓度以每克鲜重所含有的Bt毒蛋白的纳克数表示（ng／g样本鲜重）。

1.3 棉花不同时期叶片的采集及Bt蛋白含量检测

采集棉花不同生长期（子叶期、三叶期、七叶期、盛花期）的叶片，在棉田将每个时期的叶片样品以棋盘式20点取样，每点1株，共采集100 mg初展嫩叶，－70℃保存。每个样品共重复3次。加入少量液氮磨碎叶片样品，然后按1∶100（w／v）比例加入预冷抽提缓冲液（PBST，p H＝7.4）。匀浆液于4℃过夜抽提后，4℃，12 000 r／min，离心10 min，样品－70℃保存，待测。

1.4 大田昆虫的收集及体内Bt蛋白含量检测

6月中旬至7月下旬，在棉田采用随机抽样法多株收集50头棉蚜（体态大小基本一致的成虫）至1.5 mL离心管内，并称重；室内蚜虫的收集过程同上。同时随机采集龟纹瓢虫的幼虫（3～4龄）和雌、雄成虫各20头（单头称重－70°保存）；同时期的样品共重复3次；将样品在液氮中速冻30 s后，用研磨棒将其磨碎，每头棉蚜以1∶20μL，每头龟纹瓢虫以1∶100μL，用PBST（p H＝5.8，冰预冷）缓冲液4℃过夜抽提，4℃，12 000 r／min，离心10 min，样品－70℃保存，待测。

1.5 室内昆虫饲养的观测实验

室内昆虫材料主要来自2009年春季试验棉田收集的棉蚜、2010年六月上旬棉田收集的龟纹瓢虫的卵，将这两种昆虫材料进行人工室内养殖，用于室内Bt蛋白含量检测和生长发育繁殖的观察实验。

棉蚜的室内养殖采用单头棉蚜子叶叶片法［6］和大量棉蚜的网套养殖法［7］。分别用益农二号和新棉33号子叶叶片饲养的蚜虫各50头，每12 h观察并记录幼虫的蜕皮率、存活率、各龄若虫历期，单头雌蚜的终生产卵量。用网套养殖法扩繁的棉蚜用于伺喂龟纹瓢虫。

龟纹瓢虫的室内养殖法参照张桂芬［5］报道，益农二号和新棉33号各60头，每天观察并记录幼虫蜕皮率，每龄历期，各龄期的重量，存活率，蛹化率及直到成虫成熟后的随机配对日产卵量（高峰期）和整个生命期的存活时间。

1.6 数据分析

使用Cur ve Expert1.3软件绘制Bt蛋白的标准曲线，用Excel 7.0绘图，用SPSS16.0处理试验中各种数据，采用单一变量T方检验［8］。

2 结果与分析

2.1 抗虫棉不同时期叶片Bt毒蛋白的表达量

抗虫棉不同时期叶片Bt蛋白表达量测定结果表明（表1），Bt蛋白在叶片中的表达有时空差异性。5月下旬至7月中旬，棉花不同时期叶片的Bt蛋白表达量依次为：盛花期＞子叶期＞七叶期＞三叶期。在七月中旬，盛花期的叶片Bt蛋白高达303.6 ng／g鲜重。在对照棉中，在棉花的各时期的叶片中均未检测到Bt蛋白。

表1 Bt棉不同时期叶片Bt毒蛋白的表达量 ng／gTab.1 Bt toxin content in different stages＇leaf of transgenic Bt cotton plants

2.2 Bt棉上棉蚜体内Bt毒蛋白的含量测定

不同时期Bt棉田棉蚜体内Gr yl Ab／Cr yl Ac蛋白含量的测定结果见图1，图中数据为平均值±标准误差。

由图1可知：采自Bt棉上的棉蚜均可检测到Bt蛋白的存在，除6月上旬采集到的棉蚜Bt含量（6.0 ng／g鲜 重）明显较高外，6月中旬至8月初的4次测试结果没有明显差别，含量在2.8～3.7 ng／g鲜重之间。

6月上旬的Bt含量较高可能与棉蚜的生活习性、大田气候、天敌数量少、棉叶Bt蛋白含量有关。到6月中下旬至8月的棉蚜体内蛋白含量较低，棉蚜的形态较小，大田天敌数量增多，降雨量增多，这些都是制约棉蚜的取食因素。

图1 不同时期Bt棉田的棉蚜体内Cry1Ab／Cry1Ac蛋白含量值Fig.1 The content of Cry1Ab toxin protein in the body of Aphis.gossypii in Bt cotton plot in different stages注：图中数据为平均值±标准误差。

2.3 Bt棉上的龟纹瓢虫体内蛋白的含量测定

通过对Bt棉田不同时期的龟纹瓢虫体内Bt蛋白含量检测结果（表2）表明，龟纹瓢虫的3～4龄幼虫和成虫体内均可检测到Bt蛋白。瓢虫成虫体内Bt蛋白含量（16.9～27.8 ng／g鲜重）明显高于幼虫（8.4 ng／g鲜重），其幼虫体内Bt蛋白含量（8.4 ng／g鲜重）又明显高于棉蚜（3.9 ng／g鲜重）。这说明Bt蛋白在棉蚜－龟纹瓢虫之间具有传递效应。瓢虫成虫体内含量明显高于幼虫体内含量，这主要归因于瓢虫的取食量，取食量越高，其体内积聚的Bt蛋白含量越高。在常规棉上采集的昆虫样本均未检测到Bt毒蛋白。

表2 棉田不同时间段的棉蚜和龟纹瓢虫体内Bt毒蛋白的含量 ng／gTab.2 Bt toxin content in Aphis gossypii and Propylaea japonica from different cotton developing stages

2.4 Bt棉对多代棉蚜和龟纹瓢虫的生长发育影响

单头棉蚜室内连续养殖4代的观察试验结果表明，两种棉花上的棉蚜的若虫历期大约5 d左右，但Bt棉上的棉蚜若虫历期比常规棉上的略短0.5 d左右，见表3，繁殖力略比常规棉高，存活力差异不大。由此可知，益农二号対棉蚜各虫态历期均无显著性影响。经室内继代饲养试验，也未见有何不利影响。龟纹瓢虫的室内养殖观察表明，以两种不同棉花上的棉蚜为食源的龟纹瓢虫，见表4，益农二号上的棉蚜为食的龟纹瓢虫的存活力（87.3%）略比对照组（93.1%）低，说明Bt棉对龟纹瓢虫的存活率有所影响，但生长发育若虫历期、繁殖力差异不大。从整个生命参数的观测值来看，Bt棉Bt蛋白对龟纹瓢虫并未产生不良影响。

表3 棉蚜的生长历期统计表Tab.3 Statistics tables of Aphis.gossypii growth duration

表4 用不同棉田的棉蚜饲养时龟纹瓢虫若虫历期、存活率和成虫繁殖高峰期的繁殖力 25℃～31℃Tab.4 Develop mental duration and survival rate of immature Propylaea japonica and adult fecundity in their oviposition peak period feeding on the cotton aphis from different cotton plots

3 讨论

Bt蛋白在取食昆虫体内的积累主要与食物中的Bt含量有关。棉花叶片中Bt的含量随生长发育而有所增加［9］，相应地，取食棉蚜体内的Bt含量也在增长。我们在室内培养的棉蚜Bt蛋白含量（5.5～7.9 ng／g）明显高于大田棉蚜的（2.8～6.0 ng／g），其原因可能是我们在室内培养棉蚜用的是子叶期的棉苗，棉蚜主要取食子叶，而大田棉蚜主要取食部位是嫩叶和嫩尖。如前文中所述，Bt在子叶中的表达要高于幼嫩的真叶。此外，取食时间和取食量也影响Bt的积累［10］。

在棉花、棉蚜、龟纹瓢虫体内均可检测到Bt蛋白，见表2。但龟纹瓢虫成虫体内Bt蛋白含量比幼虫高，雄虫比雌虫高，主要因为不同时期，不同性别的龟纹瓢虫取食量的不同，其体内Bt蛋白含量不同。在以往报道中，曾证实龟纹瓢虫还可以在自然条件下直接取食获取Bt毒蛋白［11－12］。说明Bt蛋白能够在棉花－棉蚜－龟纹瓢虫这一食物链中传递［5］。目前许多研究表明，Bt蛋白可以在多种转基因植物的非靶标食物链中存在传递现象，如Cr yIA蛋白在转基因棉花－抗性棉铃虫－中红侧沟茧茧峰食物链间的传递［13］。CryIAc蛋白在转Bt基因水稻－稻纵卷叶螟－拟水狼蛛食物链中传递［14］，Cry1 Ab毒蛋白在转基因水稻克螟稻－褐飞虱－黑肩绿盲蝽、转基因水稻克螟稻－褐飞虱－稻虱缨小蜂等等食物链中都有所传递［15］，但以上的研究通过室内昆虫观测实验表明，Bt蛋白都未对非靶标生物产生不利影响。

虽然，Bt蛋白可以通过食物链转移至棉蚜及龟纹瓢虫体内，但并未对棉蚜和龟纹瓢虫的存活力，繁殖力及生长发育产生显著的影响（表3，表4）。这与Bt蛋白杀虫机理有关，Bt蛋白的靶标害虫主要是鳞翅目，而对其他的同翅目，鞘翅目、半翅目等昆虫无杀虫活性。近几年的棉蚜报道中，转基因棉上的棉蚜种群增长指数明显高于常规棉［16］，Bt棉上的棉蚜生命参数无显著性变化，但蚜虫生长历期都比对照棉短［17］，这与本文室内蚜虫的生命参数的观测结果相似。而刘向东研究结果相反，Bt棉上棉蚜内禀增长率略比常规棉低。棉蚜的生长历期缩短，繁殖力略高，这可能与棉花组织的Bt棉中的Bt蛋白能够通过植食者移植棉蚜至龟纹瓢虫体内后对其是否会产生影响，一直是争论的热点。一些研究表明，Bt作物上的非靶标植食者对其天敌并未产生不利影响。如取食转Bt基因棉上棉蚜的中华草蛉（Chr ysoperl a sinica）及丽草蛉（Chr ysopa f or mosa Br auer），其生长和繁殖未见显著不利影响［18］，Bt玉米饲喂的欧洲玉米螟（Ostrina nubil alis）低龄幼虫不影响小花蝽（Orius insidiosus）若虫的存活和发育［19］。转Bt基因马铃薯上的桃蚜（Myzus persicae）对集栖瓢虫（Hip podamia conver gens）存活、捕食、发育和繁殖没有影响［19］。但也有一些研究表明，Bt作物中的Bt毒素通过植食性害虫可对捕食性天敌产生不利影响，如Bt玉米饲喂的欧洲玉米螟和海灰翅夜蛾（Spodopter a littor alis）显著增高普通草蛉死亡率［20］，并延长其发育历期；另外，还有一些其他转基因作物对一些瓢虫产生不利的影响报道。Birch等［21］研究表明，转GNA（雪莲凝集素）基因马铃薯上的桃蚜降低了二星瓢虫（Adaliabi punctata）的产卵量、卵孵化率和寿命，所以说不同转基因作物的Bt蛋白通过植食性昆虫到其天敌影响各有不同。

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Transferred of Bt Protein in Non-target Organism-Aphis Food Chain

WANG Haiyan，SU Jianhui，WANG Zihua，ZHAN Jiepeng，XIANG Benchun，HUANG Xianzhong，ZHENG Yinying
（College of Life Science／Key Laboratory of Agricultrure Biotechnology of Shihezi University，Shihezi University，Shihezi 832003，China）

The expression of Cry1 Ac or Cry1Ab toxin in different leaves＇stages of transgenic Bt cotton（AgroSciences II）and Conventional cotton were detected by EILSA assay.The Bt toxic protein content in the body of Aphids and P.Japonica was measured.We observed the life parameters changement of the relative insects which was fed on different food source via the Indoor feeding experi ment.The results demonstrate that the toxic protein Cr y1Ac／Cr y1Ab＇s quantitative expression in Bt cotton＇s leaves increased with the Bt cotton growth：from the three leaf stage（121 ng／g）increased to bloom stage（304 ng／g），but the cotyledon leaf were higher t han other organs.Accor dingly，t he Bt toxin in the body of Aphids and P.Japonica could be detected in the pest-resistant cotton.The highest Bt protein content of the Aphids is 6 ng／g，the average content is 2.8～3.7 ng／g.The contentration of the Aphids when it is at the f ourth instar larvae and female and male adult P.j aponica is 8.4，16.9，27.8 ng／g respectivly on aging in Bt cotton.The effective trans mission of the Bt toxic protein is significant.In addition，indoor insect feeding test indicated that the Aphids＇ny mphal period on Bt cotton was shorter 0.5 d，the Reproduction and Molting rate was slightly higher compared with conventional cotton.However，when P.Japonica was fed on cotton aphis which collected fro m the transgenic Bt cotton plots，we found that the Ladybir ds＇develop ment and survival from hatching to emerge as well as the Reproductive ability was not significantly different fro m those of the Control.

pest-resistant cotton；Bt toxin；Aphis.gossypii；Propyl aea.j aponica；Enzy me-linked i mmunosor bent assay

R944.4

A

1007-7383（2011）04-0420-05

2011-04-29

转基因生物新品种培育重大专项（2008ZX08012-04）

王海燕（1983-）女，硕士生，专业方向为植物基因工程研究。

郑银英（1975-），女，副教授，从事植物病毒学研究；e-mail：zyycbm＠sina.cn。