李 兵,张庆芳,窦少华,孙子羽,王 羽,迟乃玉

(1.大连大学生物工程学院,辽宁 大连 116622;2.大连轻工业大学生物与食品工程学院,辽宁 大连 116034)

低温石油烃降解菌L HB16的筛选及降解特性

李 兵1,张庆芳1,窦少华1,孙子羽1,王 羽2,迟乃玉1

(1.大连大学生物工程学院,辽宁 大连 116622;2.大连轻工业大学生物与食品工程学院,辽宁 大连 116034)

自盘锦油田低温环境土样中分离到 1株低温菌,该菌能以石油烃为唯一碳源和能源。经形态学、生理生化和 16S rDNA序列鉴定:菌株LHB16为嗜麦芽窄食单胞菌 (Stenotrophomonasmaltophilia)。紫外分光光度法测定该菌在含石油 0.5%(w/v)的无机盐培养基中,20℃,振荡培养 10 d,降解率达 80.16%。经传代培养数代,降解性能稳定。GC-MS分析表明烷烃 C15～C32被完全降解。菌株 LHB16在低温地区石油污染的生物治理中有良好的应用前景。

低温;石油降解;筛选;Stenotrophomonasmaltophilia

极端环境微生物是目前微生物学研究的热点。低温菌是极端微生物之一,根据其生长温度特性分为嗜冷菌 (Psychrophilies)和耐冷菌 (Psychrotrophs)两类。其中嗜冷菌是指必须生活在低温条件下,在 0℃环境下生长繁殖,最适温度不超过 15℃,最高温度不超过 20℃的微生物;耐冷菌是指能在低温条件下生长,在 0℃～5℃可生长繁殖,最高温度可达 20℃以上的微生物[1]。这两类微生物的生态分布和低温生物学特性均存差异,它们以独特的生理功能适应环境,研究这类微生物不仅具有重要的理论意义,而且在实际应用上已经产生了日益明显的经济意义。利用低温菌对寒冷地区石油污染进行治理,已引起学者们广泛兴趣。欧、美、澳,加、日[2-6]等国对低温石油降解微生物的研究已经取得长足发展,而我国与此相关的研究则刚起步。本文就低温石油降解微生物的选育及其降解特性进行了报道。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2009年 4月采自辽河油田钻井机旁被填理油泥、油砂和附近土壤。

1.2 培养基

无机盐培养基:NaCl 10 g,NH4Cl 0.5 g,KH2PO40.5 g,K2HPO41.0 g,MgSO40.5 g,CaCl20.02 g,KCl 0.1 g,FeCl2·4H2O 0.02 g,自来水 1000 ml,pH自然。

富集培养基:无机盐培养基 +原油 5 g。

分离培养基:无机盐培养基 +原油 5 g+琼脂18 g

斜面培养基:牛肉膏蛋白胨培养基。

甘油保存培养基:50%甘油:种子液 =1:1,-25℃低温保存。

1.3 降解菌的富集和筛选

取 10 g石油污染土样加入装有 l00 ml富集培养基的 250 ml三角瓶中,20℃,150 rpm,摇床培养 10 d。取 10 ml富集培养液同条件培养,重复二次。用接种环蘸取富集液在分离培养基上划线分离。挑取生长速度快,生长良好的菌落在牛肉膏蛋白胨固体平板上划线纯化。

1.4 石油含量的测定

采用紫外分光光度法[7]测定降解体系中残油量。

1.5 残油组分 GC-MS检测

以石油醚提取残油组分。采用美国 GCMS联用仪 (HP 6890/5973)进行分析。GCMS运行条件:色谱柱:HP-5 MS,30 m ×0.25 mm ×0.25μm,配 F ID检测器,N IST谱库。进样口温度:300℃;柱温:60℃恒温 1 min,以 8℃/min升至 220℃,再以 2℃/min升至 300℃,最后停留 25 min。载气为高纯氦 (99.99%),流速为 1 ml/min。进样方式为分流进样,分流比为 100:1。进样量 1μl。

1.6 菌株的鉴定

生理生化特征鉴定参考[7-8]。16S r DNA扩 增 采 用 TaKaRa16SrDNA Bacterial Identification PCR Kit,扩增产物送宝生物 (大连)有限公司测序。将测序结果在 NCB I上与已知 16S r DNA序列进行同源性比较,在 16S r DNA序列分析的基础上,采用MEGA3.1软件构建系统发育树[10-11]。通过以上方法对菌株鉴定到种。

2 结果与讨论

2.1 菌株分离和筛选

将样品富集,涂平板,分离得到 100株低温石油降解菌,经复筛得到 1株能利用石油为唯一碳源和能源的细菌,命名为 LHB16。

2.2 菌株鉴定

2.2.1 形态学和生理生化鉴定

将复筛得到的 1株菌进行形态观察及生理生化试验,结果见表 1。

表 1 菌株形态学观察和生理生化实验结果

对菌株 LHB16的 16S r DNA进行 PCR扩增,经过3%的琼脂糖凝胶电泳检测获得约 1.5 kb大小的产物(图 2)。PCR产物回收后测序,16S rDNA序列长 1508 bp。使用 Blast进行序列同源性比较[12],菌株 LHB16与 Stenotrophomonas maltophilia(AY040357)同源性100%。图 1显示菌株 LHB16与 Stenotrophomonas maltophilia(AY040357)进化距离最小。

综合菌株 LHB16的形态特征、生理生化和 16S rDNA鉴定结果,参考文献[7-8]将菌株 LHB16鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌 (Stenotrophomonasmaltophilia)。

图 1 菌株 LHB16系统发育树

图 2 菌株 LHB16 PCR产物,M:DL2,000 DNA Marker,1:PCR产物

2.3 石油降解率测定

在 20℃条件下,振荡培养 10 d,接种量2%(V/V)时,菌株 LHB16降解率达 80.16%,传代培养数代,同条件测定,其石油降解率为82.16%。略有提高 (＜1%),表明石油降解性能稳定。

2.4 残油组分的 GC-MS检测结果

以 2%接种量将菌 LHB21接入富集分离培养基中,20℃,150 rpm恒温培养 10 d,用石油醚提取残油并浓缩,以不接菌处理做对照,对菌LHB16降解后残油 GC-MS分析 (图 3,4)。对照组经检测含有 C15～C3218种烷烃;菌株LHB16对不同碳链长度的烃类降解效果不同,石油降解程度随碳链增长而降低,C15～C32直链烷烃被完全降解,残油中未降解的组分(C22,C25-C29)主要为长链支链烷烃和杂环芳香烃。

图 3 对照残油 GC-MS图谱

图 4 菌 LHB16降解后残油 GC-MS图谱

3 结论

(1)通过对辽河油田低温石油样品富集分离,筛选得到 1株低温石油降解菌,命名为LHB16,经形态学观察,生理生化鉴定和 16s r DNA序列分析将菌株 LHB16鉴定为嗜麦芽窄食单胞菌 (Stenotrophomonasmaltophilia)。

(2)LHB16菌株对石油具有良好的降解特性,该菌在石油浓度为 5 g/L,接种量 2%(V/V)、pH自然、温度 20℃条件下,接种 10 d后对石油的降解效率可达 80%以上

(3)菌株 LHB16,能完全降解 C15～C34长链烷烃。

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Screen ing of a psychrotrophic oil-degrading Stra in LHB16 and ItsDegradation Characteristics

L IBing1,ZHANGQing-fang1,DOU Shao-hua1,SUN Zi-yu1,WANG Yu2,CH INai-yu1
(1.Bioengineering College,Dalian University,Dalian,116022,China;;2.School ofBiological and Food Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian,116034,China)

A psychrotrophic strain,designated LHB16,utilizing oil as the sole carbon source,was isolated from the soil and identified as Stenotrophomonasmaltophilia based on physiological,biochemical tests and 16S r DNA sequence.The ultraviolet spectrophotometric deter mination indicated that strain LHB16 could remove 80.16%of oil at 0.5% (w/v)concentration in 10 d at 20℃,The GC-MS analysis revealed that longchain alkanes from C15 to C32 in the oil were completely depleted.The study implied thatLHB21 is a valuable biodegradation strain deserving further attention.

psychrotroph;oil degradation;screening;Stenotrophomonasmaltophilia

X172 < class="emphasis_bold">文献标识码:A文章编号:

1008-2395(2010)06-0072-03

2010-10-23

国家"973项目"(No.2007CB707801);国家"863计划"(No.2007AA021306);辽宁省自然科学基金(No.2050775)

李兵 (1983-),男,硕士,Email:cny7566@126.com