刘晓飞，高学军*，刘 营，敖金霞，王青竹

（1.乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学，哈尔滨 150030；2.东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，哈尔滨 150030）

赖氨酸（Lysine）的化学名称为2，6-二氨基己酸，有L-型（左旋）、D-型（右旋）和DL型（消旋）三种旋学异构体。人类和动物可吸收利用的只有L-型。它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、促进生长发育均有重要作用。饲料中添加赖氨酸对单胃动物极其重要，如豆粕中添加适量的赖氨酸，可以大大提高蛋白质的利用率，促进禽畜生长。赖氨酸还决定断奶仔猪体内蛋白质合成、沉积以及其他氨基酸的利用率，赖氨酸转化为体蛋白的效率高达86%[1]。赖氨酸应用范围较广目前，有90%的赖氨酸应用于饲料工业，尤其是2003年以后，我国已成为全球最大的赖氨酸生产国。本文从赖氨酸生产现状、生物合成途径、发酵调节机制、微生物应用等方面综述了微生物产赖氨酸的研究现状及应用前景。

1 赖氨酸生产现状

L-赖氨酸最初是从蛋白质水解物中分离得到的，蛋白质水解法一般以动物血粉为原料，此法特点是工艺简单，但原料来源有限，仅适合小规模生产。后又出现了化学合成法、酶法，使用的合成法主要有荷兰的DMS（Dutch State Mijinen）法和日本的东丽法，此法最大缺点是使用剧毒原料光气，可能残留催化剂，产品安全性差，存在严重的环保问题[2]。1960年，日木首先采用微生物发酵法生产。微生物发酵生产氨基酸是人为地解除氨基酸生物合成的代谢控制机制，使其积累大量所需氨基酸。氨基酸的L-型立体专一性决定了发酵法生产氨基酸较化学合成的工艺更简单、快捷。我国于20世纪60年代中期开始进行赖氨酸菌株选育和发酵的研究，但因产量较低难以工业化。直到70年代末80年代初世界赖氨酸实现工业化后我国研究才取得突破。目前，世界约2/3的赖氨酸企业采用发酵法生产，生产的为L-型赖氨酸，生产工艺已基本成熟。近年来，赖氨酸的需求逐年增加，全世界每年大概80万t赖氨酸通过发酵生产的方式获得。

用于工业上发酵生产赖氨酸的菌株主要是棒状杆菌和短杆菌等细的变异株，棒状杆菌具有极高的经济价值[3]，其中谷氨酸棒状杆菌应用最为广泛[4]。此外，赖氨酸生产还有应用大肠杆菌[5]、黄色短杆菌[6]、酿酒酵母[7]、乳酸发酵短杆菌[8]、假丝酵母[9]等的报道。

生产赖氨酸的微生物主要有四类：野生型、营养突变型、调节突变型和营养调节突变型。工业上通过优化发酵菌种（诱变和基因工程手段）和改变发酵条件（搅拌速度、pH、溶氧、温度和CO2）来提高赖氨酸产量。获得高产微生物菌株的方法主要有传统诱变方法（紫外线、X射线、氮芥和亚硝基酯等）、原生质体融合和基因工程方法等。据报道，经过诱变菌株产生的赖氨酸提高40%～50%。诱变菌株以价格低廉的碳源为发酵原料，如各种淀粉水解糖、蜜糖、醋酸和乙醇等，发酵生产赖氨酸，通过分离、浓缩、蒸发、结晶、干燥生产工艺获得饲料级赖氨酸、再精制可得到食品级、医药级产品[10]。

2 赖氨酸的生物合成途径

2.1 天冬氨酸途径

天冬氨酸途径又称二氨基庚二酸途径，此途径多存在细菌、绿藻、原虫和高等植物中，以天冬氨酸为起始物质，还可以合成苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸[11]。

2.2 α-氨基己二酸途径

α-氨基己二酸途径存在于酵母和霉菌中。酵母主要是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisia），霉菌主要是粗糙脉孢菌（Neurspora crassa）。

3 赖氨酸的代谢调控与育种

3.1 添加结构类似物

抗类似物突变株也称为代谢拮抗无抗性突变株。选育抗类似物突变株，是目前代谢控制发酵育种的主流。选育抗类似物突变株，因为代谢调节可被遗传性地解除，在发酵时可不再受培养基成分的影响，代谢较为稳定。另外，抗类似物突变株还具有不易发生回复突变的优点。添加赖氨酸的结构类似物是采用切断或减弱支路代谢的方法来增加赖氨酸的积累。由于限制高丝氨酸（Homaserine，Hom）的补给量，使苏氨酸（Threonine，Thr）和蛋氨酸（Methionine，Met）的生成有限，从而解除了Thr和Lys对天冬氨酸激酶（Aspartate Kinase，AK）的协同反馈抑制，使Lys得以积累。s-（β-氨基乙基）L-半胱氨酸（S-（β-aminoethyl）-L-cysteine hydrochloride，AEC）是生产赖氨酸常用的结构类似物。

Aida等从日本土壤中分离得到的野生型枯草芽孢杆菌产赖氨酸2.5 g·L-1[12]。Chaudhurl等使用从印度土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌[13]，依照Adelberg的方法加入浓度为300 μg·mL-1N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍[14]（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine（carcinogen，mutagen），MNNG），在培养基中加入20 mmol·L-1AEC后得到的突变株产赖氨酸16 g·L-1，再经60 s的紫外线照射后的突变株产赖氨酸21 g·L-1。Sands等使用乳酸杆菌经过AEC四次诱变，原始菌株的赖氨酸产量不足1 μg·mL-1，而突变株赖氨酸产量达到72 μg·mL-1[15]。张伟国等以黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）ATCC14067出发，经过亚硝基胍（Nitrosoguanidine，NTG）、硫酸二乙酯（Diethyl Sulfate，DES）逐级诱变处理，用AEC、磺胺胍（Sulfaguanidine，SG）等氨基酸结构类似物及琥珀酸为唯一碳源平板定向育种，获得1株L-赖氨酸高产菌，L-赖氨酸盐酸盐产量达77～82 g·L-1[16]。Jose等以酿酒酵母为出发菌株，加入赖氨酸的结构类似物AEC，以脯氨酸为氮源，得到的突变株产赖氨酸是野生株的3～7倍[17]。

3.2 改变膜的通透性

改变细胞膜透性选育赖氨酸高产菌株是行之有效的选育途径，赖氨酸是在菌体内合成后，通过细胞膜渗透到发酵液中的。如果能够改变细胞膜的通透性，一方面可以使产物易于提取，另一方面可以降低产物在菌体中浓度，使产物不能引起反馈抑制或阻遏作用。

齐秀兰等利用L-赖氨酸产生菌钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）D60-95经紫外线诱变，使用七叶苷筛选抗性菌株，获得高产稳定菌株E0.9-37，L-赖氨酸产量为82.0 g·L-1，较出发株提高20.6%。通过优化发酵培养基使菌株E0.9-37 L-赖氨酸产量高达111.0 g·L-1，较出发菌株提高了63.2%[18]。试验证明，七叶苷对于改善细胞的通透性有一定作用。潘中明等以乳酸发酵短杆菌AL039为出发株，经亚硝基胍诱变，筛选到一株氟丙酮酸敏感型突变株FP094，其赖氨酸产量比出发菌株提高37.5%，当添加生物素的量在200～500 μg·L-1时，可以明显地提高赖氨酸的产量和转化率，证明高浓度的生物素对乳酸发酵短杆菌高产赖氨酸是有利的，因为添加过量生物素会导致生物细胞膜中更多的磷脂分子合成，限制了谷氨酸和天冬氨酸向胞外的分泌，从而使细胞内的谷氨酸对谷氨酸脱氢酶等产生反馈抑制，迫使代谢流向合成天冬氨酸的方向进行，天冬氨酸进而合成赖氨酸[19]。

3.3 增加前体物

增加天冬氨酸浓度，天冬氨酸激酶与底物的亲和力协同性增大，能够抵消变构抑制剂的影响，使前体物（丙酮酸、草酰乙酸、天冬氨酸等）充分地用于合成赖氨酸。

从葡萄糖形成赖氨酸的过程中，依赖于天冬氨酸生成的量。天冬氨酸是乳酸发酵短杆菌生产赖氨酸的前体物。赖氨酸是从丙酮酸和天冬氨酸反应转变形成的。丙酮酸激酶在变构调控作用下，化醇丙酮酸不可逆变地转化成丙酮酸[20]。Osaka等从乳酸发酵短杆菌AJ3990出发，诱发得到β-氟丙酮酸钠（EP）-敏感突变株AJ11204。AJ11204以葡萄糖为碳源，发酵在32℃进行，用加入气态氨调节pH在6.5，同时补充氧保持在0.01～0.10个大气压[21]。在过量生物素存在的条件下，发酵48 h积累赖氨酸70 g·L-1，葡萄糖转化率为50%。EP-敏感突变株的丙酮酸脱氢酶活性减弱，为出发菌株的27%，增加了丙酮酸在细胞内的浓度，大量积累赖氨酸的前体物天冬氨酸，从而得到高产赖氨酸的菌株。

Shvinka等指出赖氨酸合成中间产物草酰乙酸可由三羧酸循环或磷酸烯醇丙酮酸羧化途径获得[22]。乙酰CoA促进磷酸烯醇式丙酮酸羧化作用，添加醋酸可以增加乙酰CoA的生成，促进磷酸烯醇式丙酮酸羧化反应[23]。此外，添加醋酸可以诱导乙醛酸支路，可以补充草酰乙酸及三羧酸途径的中间产物，从而促进菌体生长和赖氨酸合成[24]。潘中明等通过试验验证，醋酸钙加量在2%左右对赖氨酸发酵最为理想[19]。

3.4 原生质体融合

原生质体融合技术是微生物遗传育种上一项重要技术，它具有遗传信息传递量大，不受亲缘关系的影响，可有目的地选择亲株以选育理想的融合株，便于操作等优点，在遗传育种中具有广阔的应用前景。

楼纯菊等进行了提高产朊假丝酵母体内赖氨酸含量的研究。通过蜗牛酶和溶壁酶制备产朊假丝酵母原生质体，将形成的原生质体紫外诱变处理来提高赖氨酸产量，所得突变株的赖氨酸含量达到8.46 g·L-1，比对照株高 41%[25]。

3.5 构建基因工程菌

利用基因工程技术构建氨基酸工程菌株，把依靠诱变技术取得的优良特性通过重组DNA技术加以组合和应用。

Anastassiadis通过扩增谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌代谢关键酶、整合DNA染色体或插入编码基因等来提高赖氨酸的产量[26]。Ohnishi等研究了谷氨酸棒杆菌产赖氨酸菌株和野生株的末端代谢途径、碳源流向、代谢互锁的相关基因。将野生株中的高丝氨酸脱氢酶和天冬氨酸激酶分别与丙氨酸突变株中的高丝氨酸脱氢酶和亮氨酸突变株中的天冬氨酸激酶等位互换，分别得到了产赖氨酸8和55 g·L-1的菌株；将以上两个突变株在野生株中重新构建，产赖氨酸75 g·L-1；将丝氨酸突变株中的丙酮酸羧化酶转入到野生株中，仅发酵27 h就得到赖氨酸80 g·L-1[27]。

赵凯等以北京棒杆菌为研究对象，通过四轮基因组重排成功选育出了5株遗传稳定的高产赖氨酸菌株，其中1株重排菌株赖氨酸产量达到16.95 g·L-1，比原始菌株的赖氨酸产量提高了37.14%，比亲本菌株赖氨酸产量提高了17.46%～31.19%[28]。

4 微生物生产赖氨酸的前景展望

中国赖氨酸产业起步于20世纪90年代初，当时赖氨酸总生产能力为每年1万t。近年来，随着我国赖氨酸产能量的高速增长，从2001年每年不足5万t增长到2005年国内赖氨酸总供给量约每年20万t；2006年，赖氨酸产量已超过32万t；2007年，国内赖氨酸的总产量约每年40万t，成为世界最大的赖氨酸生产国。

2006年，进口赖氨酸的平均价格为13.30元·kg-1；2007年，国内进口赖氨酸的均价约14.30元·kg-1，同比上涨了约6.7%；国产赖氨酸均价约14.40元·kg－1，同比上涨约10%。虽然赖氨酸价格的涨幅较大，但生产厂家的利润并未因此增加，其主要原因是原料成本和物流费用的增加。随着国产赖氨酸技术上的改进，产氨基酸优良菌种的筛选和分子育种，通过不断发掘新的菌种和改良现有的菌种，使产量增加、成本降低、质量改善、功能增强、酶活性提高，彻底实现赖氨酸国产化。使用微生物发酵赖氨酸有方便、快捷和高效等特点，具有广泛的市场空间和经济前景。

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