张海新，宁久丽，及 华

（1.河北政法职业学院园林系，石家庄 050061;2.河北省廊坊市林业局，廊坊 065000；3.河北省农林科学院遗传生理研究所，石家庄 050051）

褐变是园艺产品中普遍存在的问题，是果实品质劣变最明显的特征之一，不仅影响果品的外观、风味、营养，而且已成为贮藏加工的主要障碍。全世界每年因褐变造成的果蔬损失超过总损失量的50%[1]。果实褐变与采收后成熟老化生理衰退密切相关。R M Smock等[2]在苹果贮藏保鲜研究中发现有7类生理失调反应，包括冻害、冷害、组织衰老、缺钙、高CO2、低O2、机械损伤等均能引起果实褐变，由此可见，造成果实褐变的原因来自多方面。果实褐变可分为两大类，即非酶褐变和酶促褐变。非酶褐变是由各种非酶原因引起的化学反应而造成果肉或果皮褐变，多酚物质自动氧化随后聚合也可产生褐色物质引起褐变；酶促褐变是组织内的酚类物质在酶的作用下氧化成醌类，醌类再聚合形成褐色物质而导致组织变色。由于果实褐变多以酶促褐变为主，因此，一直是采后研究的重点。

1 酶促褐变的生化条件

1.1 底 物（酚类物质）

果实中酚类物质是酶促褐变的主要因素，引起褐变的酚类物质有100多种，可分为肉桂酸衍生物、类黄酮化合物、单宁和多巴胺4大类，主要是由碳水化合物代谢衍生出来的产物。虽然酚类物质种类繁多，但除了类黄酮外，多数酚类物质的生物合成均来自共同的前体物质苯丙氨酸，其它部分由乙酞-COA经聚酮酐途径产生。酚类物质作为酶促褐变的底物有很多报道，杏果实中的酚类物质主要是绿原酸，褐变颜色的深浅主要取决于黄烷酮的含量[3]。桃果实中PPO的天然底物因品种不同而不同，大久保桃中PPO的最主要底物是咖啡酸,而绿化3号桃则是儿茶酚[4]。马岩松等研究认为，绿原酸是南果梨褐变过程中的主要底物[5]，吴耕西等（1992）在鸭梨上同样证明酶促褐变的底物是绿原酸。有研究认为，苹果在生长期主要的酚类物质是4-甲基儿茶酚和表儿茶酸；苹果采后贮藏过程中,主要的酚类物质是绿原酸和咖啡酸[6]。可见，不同种类的果实酶促褐变的底物不同，同一类果实在不同的生长发育阶段其底物也有可能不同。

1.2 与褐变有关的酶类

国内外的研究一致认为，与酶促褐变密切相关的酶类主要是多酚氧化酶(PPO)，它是一种含铜离子的膜蛋白酶，大多存在于细胞中，有的也存在于细胞膜与细胞壁中。PPO所能引起的反应常会使果肉褐变，产生异味，并造成营养成分损失等。PPO能够催化两类不同的反应：一类是一元酚羟基化，生成相应的邻二羟基化合物；第二类是氧化邻苯二酚生成邻苯醌,两类反应均是需氧反应。L Marques等（1995）对PPO进行分离纯化鉴定后认为，PPO有几种不同的存在形式，其中最重要的一种相对分子质量为64 000[8]。在未成熟的果实中，有活性的PPO大多存在于果心部位[7],T Wakayama（1995）研究表明，果心处的PPO活性最高，其次是果肉，最后是果皮,这与果实从果心向果皮褐变的过程吻合。研究还发现PPO有同工酶存在，依据是在不同pH环境条件下PPO的活性出现两个以上的峰值[4,8]。对分离的PPO同工酶性质进行分析发现，同工酶间的性质差别较大。关于PPO活性最适宜的pH环境，研究结果存在争议。T Wakayama（1995）研究认为，pH 3.8最适宜,而其他人研究则认为pH 6.2[9]或pH 5.6[4]最适宜。而对PPO热稳定性的研究结果相对比较一致，在 60 ℃以上仍有部分活性[8，9]。

1.3 氧

氧气是生物生命活动的主要参加物质，也是生命活动中不可缺少的。正常的果实是完整的有机体，具有天然氧的屏障系统，植物组织通过表皮、气孔、皮孔、细胞间隙等气体交换系统完成植物生命过程的氧气需要，多余的氧气被排斥在组织以外，使组织与氧隔绝不褐变，说明植物组织具有很好的保护系统。有研究发现，代谢过程产生的活性氧是酶促褐变的主要需氧条件，O2-和H2O2是生物体内主要的活性氧。O2可还原基质，也可使基质氧化,H2O2在需氧的活动部位产生,并主要作为氧化剂。

2 酶促褐变的生理机制

果实褐变是一个复杂的生理活动过程，尽管前人进行了大量研究，但目前仍然不能确切阐明其生理变化机理。研究人员先后提出了多种学说理论，其中酚-酚酶的区域化分布学说是目前比较被接受的解释酶促褐变的学说之一。有研究发现，果实中的酚类物质与PPO存在着区域性分布，正常的植物组织不发生褐变主要与细胞内酚类物质和酶的区域化分布有关。鞠志国等（1988）研究证实，莱阳茬梨果实中酚类物质贮存和积累在液泡中，但不含PPO，PPO主要集中在细胞质中，也有存在于细胞膜和细胞壁上，证明了PPO与多酚的区域性分布。酚类物质与PPO的区域性分布保护了组织细胞的正常生理活动，从而防止了褐变的发生。假如果实在贮藏期间或采前生理失调，就有可能打破这些物质的区域化分布,使酶和底物相互接触，导致褐变的发生。

研究还发现，果实褐变的发生与清除活性氧自由基的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性下降以及膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）和H2O2的增加有密切的关系。蒋跃明等（1991）对香蕉褐变进行研究,证实了膜脂过氧化作用参与香蕉的褐变过程。低温条件下香蕉果皮PPO活性增高与游离态PPO比值增大，褐变伴随细胞还原势迅速降低，液泡膜和质体膜结构破坏，组织内过氧化物含量增加有关。另外，外源H2O2和抗氧剂处理对果皮褐变和过氧化物含量分别起到促进与抑制作用，说明褐变机理不只是PPO参与的酚类物质氧化过程，还包括了细胞氧化还原代谢失调和细胞结构的破坏。

3 引起果实褐变的主要因素

3.1 冷 害

许多原产于热带、亚热带或高温季节成熟的果实，在不适宜的低温条件下贮藏，往往会发生冷害，冷害发生的主要症状之一就是组织褐变。尽管冷害的发生机理目前还处在不断探索阶段，但相关研究一致认为，冷害会导致细胞膜受伤害。在冷害温度条件下，细胞膜系统发生相变，不饱和脂肪酸和磷脂含量比例下降，膜脂由液晶态转为凝胶态，细胞膜收缩产生裂痕，致使透性增加，透性变化直接扰乱细胞内的离子平衡，造成离子外渗，也就打破了细胞内多酚与PPO的区域化分布。这样，一方面会引起细胞的代谢失调且影响其正常的生命活动；另一方面代谢的中间产物如丙酮、乙醛、乙醇、多酚等会增多并累积，这又会进一步加快组织细胞的衰老和崩溃。但这种影响在短期低温内是可逆的，如果在长期低温条件下，细胞膜将发生不可逆的相变，这些有毒物质可使细胞受害，出现冷害症状。

3.2 气体伤害

通常低O2与高CO2等不适宜的气体成分会造成果实的褐变。果实置于O2浓度在1%～3%的环境中贮藏比较适宜。苹果在低氧的条件下，果皮表面会产生褐色斑，果肉形成褐色的软木斑和空洞，进而导致腐烂发生。亚洲梨在0℃、O2浓度为1%的条件下贮藏4个月，果实表皮会出现青铜色凹陷，鸭梨和雪花梨在0℃、O2浓度为1%的条件下贮藏4个月，果实表皮也会发生褐变[10]。高CO2环境下无论低温或常温贮藏，都会造成果实伤害，主要表现为果肉硬化、品质衰败、产生异味。此外，还可使琥珀酸、丙氨酸积累，延胡索酸、天冬氨酸减少，呼吸代谢的三羧酸循环系统受到破坏，使果实正常生命活动难以完成，造成有害物质积累和细胞膜伤害，从而发生酶促反应，使组织产生褐变。气体伤害引起的褐变与果实种类、采收时间、贮藏温度、贮藏时间等因素相关。

3.3 矿物质元素缺乏

有关研究表明，果树生长期间或采收后用无机盐处理会抑制褐变的发生或减轻褐变，但无机盐防止褐变的机理尚未清楚。果实在生长发育过程中，缺乏矿物质元素会影响生命活动的完成，出现生理失调，尤其是某些生物体内含量较少且不可取代的物质，对果实的生长发育和正常代谢具有明显的影响。例如果实钙素匮乏则细胞壁形成受阻，系统形成不完整，或不能与果胶酸结合成果胶酸钙而使果胶酸过多，造成细胞壁破坏和分解，使质膜呈片断状或局部松驰，细胞壁厚薄不均匀，细胞膜系统极易遭受破坏，导致褐变发生[2]。

3.4 果实成熟度与果实大小

成熟度对果实与果肉的褐变影响很大，采收期的早晚对酶促褐变的影响可能是组织衰老和自身保护酶系统互相作用的结果。经研究表明，晚采收的桃果实比早采收的桃果实容易发生褐变。不同大小的果实在贮藏过程中的褐变程度不同，一般大果实比小果实易发生褐变，原因可能与贮藏后期果心释放出来的CO2不能及时排出有关。

4 防止果实褐变的技术措施

4.1 贮藏温度调控

冷害是引起果实褐变的重要因素，采用热处理和间歇加温等温度调节措施可以有效地预防或减少冷害褐变的发生。采后热处理可以改善由于冷害引起的细胞壁物质代谢的异常，并可诱导合成小分子量的热激蛋白，减轻或抑制冷害的发生；同时热处理还可降低某些氧化酶如苯丙氨酸氧化酶、多酚氧化酶与过氧化物酶的活性，抑制组织褐变，改善贮藏品质。笔者经研究证实，采用50℃热水处理可以明显地延长冬枣和赞皇大枣的贮藏保鲜期；罗自生等研究发现，热激处理可以减轻柿果实冷害症状，显著降低低温冷害[11]。

目前，研究较多的变温模式为间歇加温，即冷敏感性果蔬在低温贮藏期间采取多次短期升温处理，使组织代谢恢复正常，可延缓甚至避免冷害的发生。D M Dawson等（1995）对桃果实和油桃果实进行间歇升温处理来延缓冷害发生，延长贮藏寿命。都凤华等（1994）研究表明，间歇加温可有效地降低李子果实呼吸强度和乙烯释放量，抑制冷害的发生。许多研究证明，间歇升温对梨、桃、柠檬、芒果、李等果实冷害发生均有一定的延缓作用。

4.2 气体调节

调控贮藏果实的气体环境是控制褐变的有效方法之一，目前采用的方式有气调贮藏、减压贮藏和自发气调贮藏等。上述方法通过降低O2浓度而相应提高CO2浓度,使之达到适宜比例,防止褐变。鞠志国报道[12]，O2浓度在5%～10%时，CO2浓度与果肉褐变呈正相关；CO2浓度相同条件下,果实不受O2（5%～20%）浓度变化的影响。在桃果实贮藏过程中，控制其贮藏环境中适宜的O2和CO2浓度可以有效地延长贮藏期。减压贮藏同样也是创造一个低氧环境，促进果实内气体成分向外扩散，减少代谢和有毒物质的积累而延缓衰老。但由于不同种类的果蔬在遗传与生理方面存在差异,对贮藏环境中的O2和CO2浓度的反应也不相同。

4.3 化学药剂处理

通过化学药剂抑制果蔬酶促褐变过程可达到抑制或延缓果实褐变的目的。应用较多的化学药剂主要有钙处理、酸处理、抗氧化剂、植物生长调节剂、PPO抑制剂、基质甲基化法等。钙处理主要是防止仁果类如梨和苹果等果实的褐变。如雪花梨在常压条件下浸泡于浓度为6%的CaC12溶液5 min或减压条件下浸泡于浓度为4%的CaC12溶液2 min，均能使果肉酚类物质保持在较高水平，抑制PPO活性并维持细胞膜结构的完整性[13]。经研究发现，焦亚硫酸钠、食盐、EDTA、谷胱甘肽、柠檬酸、抗坏血酸、亚硫酸钠、L-半胱氨酸、二氧化硫、硫磺等化学药剂均有一定程度的抑制果实酶促褐变的作用。例如在防止甘薯的褐变中抗坏血酸效果最好，柠檬酸次之，0.20%柠檬酸+0.05%抗坏血酸为最佳组合，而氯化钠效果稍差[14]。外源生长调节物质可以改变果实内源激素的平衡,进而调节果实的生理代谢，增强果实的耐冷性，减少褐变的发生，通常应用的生长调节物质主要有ABA、GA3、2,4-D、多胺等。王勇等研究发现，用ABA处理可减轻贮于8℃条件下香蕉的冷害与褐变[15]；田世平等用GA3和钙处理冬雪蜜桃，显著地减轻了贮藏期间果心的褐变程度[16]。国内外做了大量酶抑制剂的应用研究工作，探明不同植物中PPO的分子型、铜离子的存在状态不同，对不同的抑制剂会产生不同的反应。研究结果表明，利用半胱氨酸抑制梨浓缩果汁以及苹果、马铃薯的褐变，利用亚硫酸氢钠保持荔枝的色泽等均可取得较好效果。有关PPO抑制剂的报道很多，但在生产应用方面还难以取得令人满意的效果。

4.4 采前管理与采收期控制

果实成熟度越高，组织衰老越快，褐变也随之加重，同时褐变与果树栽培管理和果实营养水平也有一定关系。拟用于贮藏的果实要在充分长大、但尚未完全成熟之前采收，不同品种果实的最佳贮藏期存在明显差异，同一品种不同采收期果实的处理方式也不同。笔者利用七成、八成、九成成熟度的黑宝石李进行低温贮藏试验，结果表明，八成熟的果实贮藏效果最好，七成熟次之，九成熟最差。

5 未来的研究方向

随着生物技术的不断发展与进步，通过基因工程培育抗褐变果蔬品种己经成为现实。C W B Bachem等（1996）通过农杆菌介导，分别将PPOcDNA片段和cDNA全长加上合适的启动子，反向插入到马铃薯的染色体组内，成功获得了抗褐变的马铃薯新品系，这一成功技术证明基因工程可以运用到果蔬抗褐变品种培育中。随着生物化学和分子生物学的迅猛发展，尤其是酶纯化技术、免疫技术、PCR技术、反义RNA技术等的成功应用，番茄、马铃薯、甘薯、菠菜、葡萄、菠萝、苹果、梨、桃、日本枇杷、中国木瓜、荔枝、茶树等园艺植物的PPO基因已被克隆，有望进一步应用于苹果、香蕉、梨等抗褐变果蔬的培育改良上，为控制果蔬等农产品的酶促褐变提供一条新途径。

另外，对果实褐变因素进行深入研究，从分子水平搞清酶促褐变机理，有望为控制酶促褐变提供切实可行的新方法。

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