罗怡 吴继红 张圣海 徐萍 卢奕

·临床研究·

老年性白内障合并2型糖尿病患者晶状体上皮细胞转化生长因子β表达及其与晚期糖基化终末产物的相关性△

罗怡 吴继红 张圣海 徐萍 卢奕

目的研究转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)在老年性白内障合并2型糖尿病患者中的表达变化及其可能的作用机制,为进一步阐明老年性白内障合并2型糖尿病患者发病的分子机制提供实验数据。方法分别采用点杂交和实时荧光聚合酶链反应方法定量检测和分析老年性白内障患者及老年性白内障合并2型糖尿病患者晶状体前囊膜上皮细胞中TGF-β蛋白、mRNA表达水平。免疫荧光方法观察晚期糖基化终末产物(advanced glycation endoproducts，AGEs)对体外培养人晶状体上皮细胞TGF-β表达的影响。结果与老年性白内障患者相比，老年性白内障合并2型糖尿病患者晶状体前囊膜上皮细胞中TGF-β(TGF-β1/2/3)蛋白表达增加(Plt;0.05)，mRNA表达变化分别为TGF-β1升高(Plt;0.05)，TGF-β2降低(Plt;0.01)，TGF-β3未见显著改变(Pgt;0.05)。AGEs与晶状体上皮细胞共培养后，细胞表面TGF-β(TGF-β1/2/3)表达上调。结论TGF-β在老年性白内障合并2型糖尿病患者晶状体上皮细胞中的表达上调。AEGs可诱导晶状体上皮细胞TGF-β表达上调。(中国眼耳鼻喉科杂志，2010，10：212-214)

糖尿病； 白内障； 晶状体上皮细胞； 转化生长因子β； 晚期糖基化终末产物

转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)可调节晶状体上皮细胞的增殖和分泌，因而在老年性和后发性白内障形成过程中起了重要作用。但TGF-β是否参与老年性白内障合并2型糖尿病患者白内障的发生及其可能的作用机制，国内外尚罕见报道。本实验采用细胞学和分子生物学技术，研究老年性白内障合并2型糖尿病患者晶状体上皮细胞TGF-β蛋白及mRNA的表达水平，初步探讨TGF-β表达变化与晚期糖基化终末产物(advanced glycation endoproducts，AGEs)的相关性，为全面阐明老年性白内障合并2型糖尿病患者发病的分子机制提供实验数据。

1 资料与方法

1.1 资料 选取2007年12月至2008年3月期间我科收治的老年性白内障合并2型糖尿病患者48例(经内科明确诊断为2型糖尿病,病史5年以上)，其中男性20例，女性28例；年龄60～82岁，平均(70.2±10.0)岁。老年性白内障患者54例，其中男性20例， 女性34例；年龄54～80岁，平均(69.4±12.0)岁。术前排除青光眼、眼底视网膜脱离、葡萄膜炎、眼外伤等病变或其他内眼手术史。糖尿病患者术前血糖均稳定在8.2 mmol/L以下，老年性白内障患者术前血糖为4.3～6.1 mmol/L，平均(5.2±0.9)mmol/L。全身检查无特殊病变。

1.2 样本采集 两组分别经我科行常规白内障超声乳化人工晶状体植入手术取晶状体前囊膜：术中用撕囊镊行前囊膜环形撕囊，所得前囊膜大小为5～7 mm，立即置入去RNase酶的EP管中，-80 ℃保存待用。

1.3 晶状体前囊膜TGF-β蛋白表达的检测 晶状体前囊膜经组织裂解液裂解后，抽取蛋白，加热变性。分别取2 μL上述蛋白样品滴加在硝酸-纤维素膜上，室温晾干。5%牛血清白蛋白封闭20 min后，一抗(Neomark, 1∶200)室温孵育30 min。TBS/T漂洗3次，加入二抗(Invitrogen, 1∶500)室温孵育30 min。最后以ECL化学发光剂(Thermo公司)孵育1 min，X线胶片曝光、显影、定影。将5例前囊膜标本合并为一个样本。每组5个样本，每个样本重复实验2～3次。采用ImagePro 软件进行密度灰度值定量分析。

1.4 晶状体前囊膜TGF-β亚型mRNA表达的定量分析 采用RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公司)分别制备两组患者的晶状体前囊膜总RNA。以β-actin作为内参，所有待测样本均做复孔，实时荧光聚合酶链反应(ABI 7000，ABI公司，美国)检测TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三种亚型的mRNA表达。扩增条件：95 ℃ 2 min预变性，然后按94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，扩增40个循环。引物序列见表1。各个样本不同指标的定量结果均用相应的β-actin定量结果标化。

表1 转化生长因子β1/2/3基因上下游引物序列

注：TGF-β为转化生长因子β

1.5 人晶状体上皮细胞(lens epithelial cell, LEC)培养及AGEs干预 本研究所采用的人LEC为美国ATCC公司产品。采用补充了10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养液(Gibco公司，美国)。预先将无菌的小玻片放置在24孔细胞培养板的培养孔中，分别按每孔2×105将LEC细胞接种在小玻片上，24 h后细胞贴壁。将终浓度为1、5、10 mg/mL的AGEs加入到LEC细胞的培养液中，隔天加1次。7 d后取出小玻片，以4%多聚甲醛固定20 min，用于免疫荧光检测。

1.6 LEC细胞TGF-β表达的观察 以0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH值为7.4)漂洗固定在小玻片的LEC细胞；加入磷酸盐缓冲液稀释的一抗TGF-β(NeoMarker公司，1∶200)，37 ℃孵育2 h；磷酸盐缓冲液漂洗细胞3次，加入荧光二抗(Invitrogen公司，1∶500)，37 ℃孵育50 min；磷酸盐缓冲液漂洗后加入DAPI孵育5 min，套染细胞核；Mowvil封片，正置荧光显微镜(Leica公司，德国)观察荧光表达。

1.7 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件处理数据,单因素方差分析比较组间差异,以Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

老年性白内障合并2型糖尿病患者LEC中TGF-β的点状范围均较老年性白内障患者的大，背景清晰(见附1页图①)。TGF-β在老年性白内障合并2型糖尿病患者LEC中的表达高于老年性白内障 (Plt;0.05)。TGF-β1 mRNA 在老年性白内障合并2型糖尿病患者LEC内的表达高于老年性白内障，差异有统计学意义(Plt;0.05)；TGF-β2 mRNA表达则低于老年性白内障(Plt;0.01)；TGF-β3 mRNA在LEC表面的表达峰度高，但两组间差异无统计学意义(Pgt;0.05)，详见表2和附1页图②。不同浓度的AGEs与人LEC共培养7 d后，TGF-β红色荧光均较正常对照组增强(附1页图③)。

表2 转化生长因子β三种亚型mRNA在两组患者晶状体上皮细胞中的表达(pg/mL)

3 讨 论

糖尿病性白内障发病的分子生物学机制至今仍不明确。越来越多的研究表明，AGEs在老年性白内障合并2型糖尿病的发生中起着关键作用[1]。然而AGEs如何介导以前囊膜下或后囊膜下纤维混浊为主要病变特点的老年性白内障合并2型糖尿病患者白内障的发生，目前国内外尚罕见报道。本实验通过对临床标本的分析发现，老年性白内障合并2型糖尿病患者LEC中TGF-β表达较老年性白内障患者显著上调，其中mRNA表达上调以TGF-β1为主。体外研究进一步发现，AGEs可诱导LEC中TGF-β表达。这些结果提示，AGEs可能通过诱导LEC中TGF-β的表达而参与老年性白内障合并2型糖尿病患者白内障的发生。

TGF-β有5种亚型,即TGF-β1～β5。 其中TGF-β1～β3存在于哺乳动物中,TGF-β1和TGF-β2蛋白及其mRNA表达于绝大多数眼组织，TGF-β3仅表达于晶状体上皮组织和纤维，房水和玻璃体中无表达，LEC中同时表达有3种TGF-β亚型的受体[2]。 TGF-β通过对LEC的影响，在后发性白内障的形成中起了重要作用，此外在老年性核性和皮质性白内障的LEC中，TGF-β的含量不同，导致两者的发病机制和病理改变不完全相同[3-5]。Liu等[6]发现在培养的大鼠晶状体中加入TGF-β能诱导前囊膜下白内障的发生。小鼠晶状体纤维细胞中活性TGF-β过度表达也引起前囊膜下白内障[7]。Mcavoy等[2]认为TGF-β能通过促进LEC间质化来诱导白内障。Lee和Joo[8]的实验表明,在前极性白内障的LEC中TGF-β的表达显著增加,并分析为TGF-β通过增强纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、平滑肌肌动蛋白的mRNA表达而发挥作用。由此可见，TGF-β通过调节LEC的增殖和分泌在各种类型白内障的发病中起了重要作用。笔者[9]曾报道TGF-β在老年性白内障合并2型糖尿病患者的前房液中含量的改变。本实验以老年性白内障作为对照，发现老年性白内障合并2型糖尿病患者LEC中TGF-β蛋白表达增加，同时通过体外实验探讨了TGF-β表达上调的机制与AGEs有关，两者可能是老年性白内障合并2型糖尿病患者发病机制分子链中的重要环节。

本实验发现TGF-β2的mRNA在老年性白内障合并2型糖尿病患者前囊膜中表达较老年性白内障者低。TGF-β2具有双向功能:一方面对于胚胎层的细胞具有加速分裂增殖,另一方面又具有抑制细胞的作用。TGF-β2可通过调节LEC增殖状态,从而在白内障发生过程中起重要作用。有研究[10-11]表明，老年核性白内障组LEC中TGF-β2 mRNA的水平低于老年皮质性白内障组。老年核性白内障的发生与LEC增殖有关,而皮质性白内障的发生与LEC的退行性变有关。本实验结果提示：白内障合并2型糖尿病患者的晶状体TGF-β2 mRNA表达下降，LEC的增殖抑制作用减弱，与老年核性白内障相似。

本实验探讨AGEs、TGF-β与老年性白内障合并2型糖尿病患者发生的内在相互联系。在今后的实验中可深入研究老年性白内障合并2型糖尿病患者中TGF-β各亚型的表达变化及与AGEs的关系，为全面阐明老年性白内障合并2型糖尿病患者的分子发病机制提供新的思路和数据。

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(本文编辑 诸静英)

试题7.答案：B。UGH综合征多发生于前房型人工晶状体，也可见于后房型人工晶状体。其原因为人工晶状体或晶状体襻与虹膜及房角不断摩擦，从而引起顽固性葡萄膜炎、反复出血和继发性青光眼。

Expressionoftransforminggrowthfactor-βinlensepithelialcellsofdiabeticcataractanditsrelationshipwithadvancedglycationendoproducts

LUOYi,WUJi-hong,ZHANGSheng-hai,XUPing,LUYi.

DepartmentofOphthalmology,EyeEarNoseandThroatHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China

LU Yi,Email:luyi_eent@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression of transforming growth factor-β(TGF-β) in the lens epithelial cells of diabetic cataract.MethodsAnterior capsule lens epithelial cells from the diabetic cataract patients and age-related cataract patients were extracted to detect TGF-β protein and mRNA expression by using dot blot and real-time polymerase chain reaction respectively. Observation of TGF-β expression of the lens epithelial cells after coculture of TGF-β and AGEs was done by method of immunofluorescence staining.ResultsProtein expression of TGF-β in the anterior capsule lens epithelial cells in the diabetic cataract significantly increased, compared to that in the age-related cataract. Regarding the mRNA expressions of the three subtypes of TGF-β, TGF-β1 mRNA expression increased(Plt;0.05), TGF-β2 mRNA decreased(Plt;0.01), and no significant change in TGF-β3 mRNA(Pgt;0.05) was found. TGF-β expression of lens epithelial cells enhanced after coculture with AGEs.ConclusionsThe expression of TGF-β in the lens epithelial cells of diabetic cataract significantly increased in comparison with the age-related cataract. The enhancement of TGF-β expression in the cultured lens epithelial cells was induced by AGEs. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2010,10:212-214)

Diabetes mellitus; Cataract; Lens epithelial cell; Transforming growth factor-β; Advanced glycation endoproducts

上海市科技发展基金资助项目(08495801700)

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 上海 200031

卢奕(Email:luyi_eent@yahoo.com.cn)

2010-01-18)