陈韶红,张永年,李树清,艾 琳,陈家旭

2.上海出入境检验检疫局

近年来,随着社会的发展,人们的膳食结构及烹饪方式也在逐步发生变化,特别是生食和半生食方式的引入和推广,鲜活鱼类(包括蟹、螺、蛙、龟、鱼)等水产品的摄入量较以往大大增加,使得食源性寄生虫的人体感染率猛增。水产品中华支睾吸虫和并殖吸虫的感染度在许多地区呈上升趋势,并殖吸虫病和华支睾吸虫病在一些大中城市屡见暴发,水产品中寄生虫囊蚴的检测已经成为食品安全的首要问题。传统检测水产品中寄生虫囊蚴的方法是用消化法解剖镜下检查吸虫囊蚴〔1〕,但需要检测人员具有丰富的镜检经验,且有操作时间长、易漏检的缺点,本研究在传统镜检的基础上,建立了FTA法检测水产品中吸虫囊蚴的定量PCR技术,为相关的监督执法、行政的监督监测等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 水产品样本 含华支睾吸虫囊蚴的麦穗鱼(采自广西省北海市);含并殖吸虫囊蚴的溪蟹(采自浙江省永嘉县)、含东方次睾吸虫囊蚴的淡水鱼(采自广西省北海市)。

1.2 主要仪器 PCR仪(美国ThermoPX2),凝胶分析成像系统(Bio-RAD公司Quantity on 4.6.6),低温离心机(美国Thermo公司);直径6mm打孔机(Whatman公司)

1.3 主要试剂

1.3.1 FTA卡(Whatman公司)

1.3.2 FTA卡洗液T E buffer(0.01 mol/L T ris-HCl,pH 8.0 0.1 mmol/L EDTA)(Whatman公司)

1.3.3 2×Taq PCR Master Mix(0.1U Taq Polymerase/L 、500 μ mol/L dNTP 、20mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、100mmol/L KCl、3mmol/L MgCL2 、其它稳定剂和增强剂)-由上海生工生物制品有限公司。

1.3.4 TAE电泳缓冲液(储备液 50×)：Tris碱242g、冰醋酸 57.1mL、0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)100 mL,用蒸馏水定容至1000 mL,混匀,室温保存。使用时取2 mL 50×TAE电泳缓冲液,稀释为200 mL工作液(0.5×)即可。

1.3.5 溴化乙锭、琼脂糖、0.1 mmol/L EDTA(pH 8.0)、10 mmol/L T ris-HCl、2%胃蛋白酶 。

1.3.6 Wizard SV Genomic DNA Purification System Promega试剂盒。

1.4 引物合成

1.4.1 华支睾吸虫囊蚴引物合成：引物由上海生工生物技术公司合成(见表1)。……