申琳子 冯慕华 李文朝 王 超

(1.中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室，南京，210008;2.河海大学环境科学与工程学院，南京，210098)

简单复垦对磷矿废弃地磷释放的影响模拟实验*

申琳子1，2冯慕华1＊＊李文朝1王 超2

(1.中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室，南京，210008;2.河海大学环境科学与工程学院，南京，210098)

针对简单复垦方式对磷矿废弃地污染物释放的影响开展研究，通过室内培养实验，比较磷矿石、废土石和对照土壤栽培烟草和玉米后污染物的释放量和土壤生物理化性质的关系.研究结果表明，根际土壤可溶性PO3－4、F－和Ca2+均比非根际土壤和空白土壤显著提高(P＜0.05)，解磷细菌增加了1—2个数量级.矿土Ca2+的释放不受作物类型的影响，可用于指示矿物相分解程度;PO3－4的释放主要受土壤Al-P组分控制;矿土F－的释放量与可溶性Ca2+和PO3－4紧密相关.研究结果表明经过简单复垦，废土石的磷污染物释放量最大，磷矿石存在较高的潜在分解风险.

磷污染，解磷细菌，磷矿废弃地.

磷矿资源开发利用使内生环境的磷污染物进入表生环境，加快了磷的地球化学循环过程.抚仙湖流域蕴藏着丰富的高品位磷矿资源，大规模露天磷矿开采对抚仙湖水体营养水平升高具有直接作用［1］.目前，该地区磷矿废弃地修复工作几乎为零，当地居民在磷矿废弃地上直接种植烟草、玉米等农作物.这种简单复垦方式对磷矿废弃地磷污染物释放的影响尚不得而知.从18世纪60年代开始，就有尝试将磷灰石未经化学处理，直接磨成细粉作为肥料施用［2］.微生物分解作用能使矿物溶解速率增加几个数量级［3］.钟传青等［4］在不同来源的磷矿粉中接种磷细菌，使磷矿粉中大部分难溶磷转化为有效磷.Hutchen［5］指出在磷灰石中接种细菌可以明显促进磷灰石的溶解.大量研究表明，大部分解磷微生物出现在植物根际土壤中［6-7］.赵小蓉［6］通过分析玉米根际与非根际解磷细菌的分布特点，发现根际分泌物促进磷细菌生长，增强土壤溶磷能力.植物根际分泌物作用和根际环境的微生物活动能够促进磷灰石的溶解，从而使磷灰石的磷由难溶态转变为生物可利用态［8］.以往的研究利用这些特性改善磷矿粉肥效，但对于矿山修复而言，植物生长对磷矿石的溶解作用有可能造成磷矿废弃地磷污染物淋溶流失.

为了摸清简单复垦对磷矿废弃地磷污染物释放的影响，本文采用室内培养实验，研究经济作物对磷矿石和废土石中磷污染物释放影响的机理，为抚仙湖流域磷矿废弃地生态修复提供理论依据.

1 实验部分

1.1 实验对象

待试磷矿石、废土石采自云南省抚仙湖流域帽天山磷矿区.其中磷矿石采自尚未开采完的磷矿区，分别采集表层磷矿石和里层磷矿石.贫矿为磷矿废弃地堆积的低品位矿石.废土石样品以磷矿层顶板和夹层剥离处的无粘性灰色粗粒土为主.对照土采自南京紫金山.样品风干后，经过粗碎、细碎、粗对滚、细对滚等步骤，制成粒径1 mm粗粉，再进行分样和细磨，通过100目尼龙筛，用于种植玉米和烟草.

1.2 盆栽实验

矿石粉、废土石粉和对照土壤中添加N、K肥，使其含量均为0.4 g·kg－1，用于种植玉米(农单5号)和烟草(催芽MS云烟87).烟草采用漂浮育苗，玉米采用直播方式.每天用去离子水补充水分损失，培养4个月后收割.根际土壤采用抖根法获取.非根际土壤为同样培养条件下，没有种植植物的土壤.空白为未进行处理的样品.湿土壤样品置于4℃冷藏保存待测.每种处理均做平行.

1.3 磷细菌测定及其培养基

按常规10 倍稀释法稀释样品，分别取10－4、10－5、10－6三个稀释度的样品 0.1 ml，采用平板划线分离法，分别涂于无机磷和有机磷固定培养基平板上，有机磷培养基在28℃培养2 d，无机磷细菌培养7 d，具有透明溶磷圈的菌落视为具有解磷活性的菌落［9］，分别计磷细菌与细菌总数.每个稀释度均作4组平行.

无机磷细菌固体培养基:葡萄糖10 g、酵母粉0.5 g、CaCl20.1 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、琼脂18 g、蒸馏水1000 ml，灭菌，临用前每50 ml中加入10 mL 10%CaCl2和1 mL 10%的K2HPO4混合液，调节pH 7.0.

有机磷细菌固体培养基:蛋白胨 10 g，牛肉膏 3 g，NaC1 5 g，琼脂 18 g，蒸馏水 1000 ml，pH 7.2，灭菌，临用前每50 ml中加入新鲜蛋黄液3 ml(蛋黄与无菌生理盐水等比例混合).

1.4 样品分析

矿石和土壤性质测定:按照土壤无机形态测定方法［9］，取100目筛的干燥磷矿石粉、废土石粉和对照土壤样品各0.500 g，对铝磷(Al-P)、铁磷(Fe-P)、闭蓄态磷酸盐(O-P)和钙磷(Ca-P)进行连续分级提取.每次提取结束，5000 r·min－1离心10 min，吸取上清液10.0 ml，用钼锑抗分光光度法测定上清液中的磷含量.采用土壤全磷测定法(HClO4-H2SO4法)测定总磷含量(TP)［10］.有效磷(Olsen-P)采用碳酸氢钠法［10］，全氟(TF)采用碱熔-TISAB 标准加入法［11］，有机质(OM)采用重铬酸钾容量法［12］，采用水土比1∶1的泥浆测量土壤pH值.每组实验均做2个平行.土壤性质见表1.

表1 磷矿石和对照土化学性质和磷组分分布Table 1 Selected chemical properties and phosphorus fractions of air-dried soils

根际、非根际和空白土壤样品可溶性组分测定:水土比5∶1，充分混合，振荡2 h，抽滤上清液测定和 F－含量.其中 Ca2+采用 EDTA 滴定法［12］，F－采用离子选择电极法［12］采用钼锑抗分光光度法［10］测定.

根际和非根际土壤样品中解磷细菌解磷能力测定，按文献［9］进行:将稀释度为10－1的土壤悬浮液1 ml接种到30 ml灭菌的有效磷培养基中，于30℃恒温箱中培养21 d.取出过滤，滤液中加入15mL 0.1 mol·l－1HCl，振荡15 min后加入无磷活性炭1 g，充分摇匀，减压过滤至滤液清亮.用钼锑抗比色法［10］测定滤液中磷含量，分别表征无机解磷菌的解磷能力(Pinorg)和有机解磷菌的解磷能力(Porg).

有效磷培养基:10 g葡萄糖、0.5 g(NH4)2SO4、0.3 g MgSO4·7H2O、5.0 g CaCO3、0.3 g NaCl、0.3 g KCl、0.03 g FeSO4·7H2O、0.03 g MnSO4·4H2O、蒸馏水1000 ml.每30 ml培养基中，有机磷培养基中加入卵磷脂酒精溶液1 ml，无机磷培养基中加入磷灰石50 mg，于110℃灭菌30 min.

1.5 数据处理

统计分析使用的软件为SPSS 11.5 for Windows(SPSS Inc.，USA).逐步多元回归分析用于建立培养烟草和玉米的根际土壤可溶性F－、P－和Ca2+含量与土壤生物理化因子之间的关系.多元回归模型总体检验用F检验和确定系数r.

2 结果与讨论

2.1 土壤性质

实验所用磷矿石、废土石和对照土壤均为偏酸性.磷的形态分布相似，均以基性钙磷(Ca-P)为主，闭蓄态磷酸盐(O-P)为痕量水平.不同土壤各形态无机磷分布趋势为废土石和对照土Al-P和Fe-P含量较其它三种矿石高，而Ca-P含量相对较低，这是由于废土石和对照土均为基岩风化土壤，未受到耕作影响.其它三种矿石Ca-P占90%以上，说明矿石成分主要是磷灰石.磷矿石中P、F几乎全部来自磷灰石［13］，因此矿物相中P和F比重能够反映矿物组成结构.三种矿石土壤性质接近.里层矿石P∶F为3.01，比例与 Ca10(PO4)6F2一致［14］，而表层矿石和贫矿的 P∶F分别为2.63和1.83，三种矿石结构组成存在差异.矿石和废土石有效磷含量较高，可以满足作物对磷的需求［15］，而对照土有效磷含量相对较低.

2.2 植物对矿石化学组分形态变化的影响

分别对栽培烟草和玉米根际土、非根际土和空白的可溶性F－、P－、Ca2+含量进行分析，分析结果如图1所示.与对照土壤相比，磷矿山采集的里层矿石、表层矿石、贫矿和废土石可溶性F－含量分别高于对照4.5倍、4.5倍、0.2倍和8倍，可溶性P－含量高12.5倍、7.6倍、7.8倍和2.5倍.可溶性化学组分浓度增加表明在外界作用下矿物发生分解，从而使化学成分由稳定的矿物相转化为易解离的活动相，易受降雨等淋溶作用释放进入地表环境.

图1种植烟草和玉米前后土壤中可溶性P－、F－、Ca2+、pH变化比较Fig.1 Dissolved P－，F－，Ca2+and pH in bulk soils and soils planted with tobacco and maize

比较空白土壤可溶性Ca2+浓度，废土石＞贫矿＞对照土＞表层矿＞里层矿，说明废土石结构最不稳定，而里层磷矿石矿物相结构最为稳定.除贫矿外，玉米根际土壤可溶性Ca2+浓度均高于烟草.这种变化趋势也体现在与空白相比，根际土壤可溶性F－和P－的变化量上，种植烟草和玉米的废土石中可溶性F－和P－浓度平均分别增加了1.4倍和1.9倍，贫矿分别增加了1.3倍和0.55倍，对照土增加了0.34倍和1.7倍，表层矿增加了0.34倍和0.49倍，里层矿仅F－增加了0.06倍.与对照土壤相比，进行简单复垦对废土石和贫矿的影响最大，尤其是废土石的分解最为显著;而表层磷矿由于暴露在地表，经受物理化学风化作用，表面结构相对较为松散，因此相对里层磷矿来说易被微生物和根际分泌物所分解.

2.3 植物体内磷分布

分析烟草和玉米体内磷的分布情况可知，和对照相比，三种磷矿石粉种植的烟草体内磷含量升高了1.1倍—1.9倍，废土石种植的烟草磷含量与对照土差别不大;而磷矿废弃地采集的4种样品用于种植玉米，磷含量比对照土壤提高3.2—5.9倍(表2).烟草和玉米体内磷含量变化趋势和样品TP含量成正相关(R=0.99和0.81)，说明植物能够分解并且吸收矿石的磷组分.不同植物蓄积磷的部位不同，烟草体内的磷主要蓄积在叶片和根部，而玉米体内的磷主要蓄积在根部.并且不同植物对磷的吸收能力不同，玉米体内磷含量远远高于烟草，说明玉米对矿石具有较强的分解吸收能力，能使更多的矿物相磷转化为植物可利用磷，这与两种农作物根际土壤可溶性Ca2+浓度的分布趋势一致.根际微环境中除了植物根系及其根际分泌物直接与矿石微界面发生作用，微生物也起着至关重要的作用.

表2 不同矿石和土壤种植的植物体内磷分布(mg·g－1)Table 2 Distribution of phosphorus in maize and tobacco planted in different soils

2.4 根际非根际土壤解磷细菌的分布

在植物生长过程中，根际不仅从环境中摄取养分和水分，同时也向生长介质中分泌质子，释放无机离子，溢泌或分泌大量有机物.这些植物根系分泌物也为根际微生物提供了营养和能源物质，从而使根际微生物的数量和活性高于非根际土壤中的微生物.对种植烟草和玉米的根际和非根际土壤中解磷细菌数量分布进行分析，结果见表3.种植烟草和玉米的根际土壤中都存在大量能够分解卵磷脂和溶解磷酸钙的细菌，解磷菌数量达到105—106cfu·g－1，而且两种细菌数量相差不大.而非根际土壤有机磷细菌数量仅为103cfu·g－1，无机磷细菌数量为104cfu·g－1.根际土壤中有机磷细菌数量比非根际土壤增加2个数量级，无机磷细菌数量增加1个数量级，可见根际分泌物更有利于有机磷细菌的繁殖生长.根际土壤解磷细菌数量增多与根际土壤可溶性和Ca2+浓度增加呈相同趋势，说明土壤解磷细菌对矿物相的分解具有关键作用.大量研究表明解磷细菌对磷矿具有很强的溶解能力［4，17］，不仅微生物对磷矿具有直接分解破坏作用，微生物代谢产物与矿石表面的反应更为重要［5］.

不同植物根际微生物数量不同，由表3可知，烟草根际土壤解磷细菌数量普遍高于玉米根际土壤，有机磷细菌数量高0.1—3.2倍，无机磷细菌数量高0.2—15.5倍.但烟草和玉米根际土壤可溶性F－、和Ca2+浓度差别并没有呈现同样的趋势(图1).说明根际微生物数量的增加虽然有利于矿物相的分解，但微生物种类、根际分泌物类别等决定了矿物相的微界面过程［4］.

表3 种植烟草和玉米前后5种土壤解磷细菌数量分布变化(×105cfu·g－1干土)Table 3 Amount of phosphorus-solubilizing bacteria in rhizosphere soils of tobacco and maize and nonrhizosphere soils(×105cfu·g－1air-dried soil)

以往的研究也表明，不同植物根际细菌不仅数量不同，种类上也存在区别.赵小蓉等［5］研究发现，玉米根际有7个解磷细菌菌属，主要为假单胞菌属和黄杆菌属，而小麦根际为5个解磷细菌菌属，主要是假单胞菌属;于翠等［18］在大青叶根际土壤中分离到6个解磷菌属，以芽孢杆菌属和假单胞菌属为主.不同种微生物及其代谢产物对矿物的作用机理有待进一步研究.

2.5 根际与非根际土壤微生物解磷能力比较

对种植烟草和玉米的根际和非根际土壤微生物对有机磷和无机磷的分解能力进行分析，采用微生物作用后系统有效磷含量进行衡量，结果如图2所示.与非根际土壤相比，种植烟草的里层矿、表层矿和贫矿三种根际土壤的微生物对无机磷的分解能力提高了6.5—17.2倍，对有机磷的分解能力提高了1.0—4.0倍，而废土石和对照土壤种植植物前后土壤微生物的解磷能力变化不明显.种植玉米的根际土壤微生物对有机磷的分解能力比非根际土壤提高了1.0—9.5倍(无机磷的数据缺失).比较图2和表3的数据，种植烟草和玉米根际微生物对有机磷的分解能力与细菌数量不存在相关关系，验证了玉米和烟草根际土壤存在不同种类的微生物，从而对矿物相的分解能力有所差别.由于磷矿石具有高浓度的磷，微生物长期作用将使稳定的矿物相磷转化为可溶态，从而使矿石具有更高的分解风险和污染物潜在释放能力.

图2 种植烟草和玉米根际和非根际土壤微生物对无机磷(a)和有机磷(b)分解能力的比较Fig.2 Changes of bacteria solubilizing ability for inorganic phosphorus(a)and organic phorphorus(b)in different soils

2.6 土壤可溶性 Ca2+、P－和F－与土壤生物理化因子之间的关系

植物对矿物的分解是一个复杂的根际作用过程，不仅与植物自身生理机能有关，还取决于土壤本身性质［19］，如土壤pH、OM、矿物相结构、污染物总量，同时也受根际微生物作用的影响，这一过程最终体现为根际土壤可溶性元素浓度的变化.采用多元逐步回归分析方法建立根际土壤可溶性元素与土壤生物理化因子的关系，结果如表4所示.玉米和烟草根际土壤Ca2+的释放量不受作物类型影响，均由土壤有机质含量和无机磷菌数量决定，证实了土壤Ca2+作为矿物相分解程度指示元素的可行性.而土壤P－的释放主要受土壤Al-P含量控制.不同植物系统的影响因子不同，玉米根际土壤P－的溶出量由Al-P，Fe-P和TF决定，而烟草根际土壤P－的释放与Al-P，有机磷细菌和有机磷菌解磷能力有关.McDowell和Sharpley［20］的研究表明大部分土壤Al-P成分是控制P溶解性的主要因子.这也解释了Al-P和Fe-P比重较大的废土石和对照土，种植烟草和玉米后的根际土壤中P－浓度升高程度最大，分别为1.9倍和1.7倍(图1).玉米根际土壤F－受Olsen-P，Fe-P和Al-P的影响，而烟草根际土壤F－主要受土壤OM，有机磷菌解磷能力和无机磷菌数量影响.土壤F－的释放量受到影响Ca2+和P－的理化因子的综合作用，这是由于磷矿石中Ca、F、P三者之间存在计量关系［13］，F－的释放与Ca2+和P－密切相关.土壤生物理化因子决定了土壤可溶性Ca2+、P－和F－的含量，对土壤生物理化因子的分析，有助于预测矿物相的分解程度，得到Ca2+、P－和F－的潜在释放量.

简单复垦方式将增加磷矿废弃地磷污染物淋溶量，从而使更多的矿物相磷转化为可溶态磷而进入水环境中，加快了磷的地球化学循环过程.因此有必要摸索一套与污染治理相结合的生态修复技术，从源头有效控制污染产生，减少入湖污染末端治理的压力和费用.

表4 根际土壤可溶性Ca2+、P－和F－与土壤生物理化因子的多元回归方程Table 4Multiple parameter regression equations for Ca2+，P－and F－as a function of soils properties

表4 根际土壤可溶性Ca2+、P－和F－与土壤生物理化因子的多元回归方程Table 4Multiple parameter regression equations for Ca2+，P－and F－as a function of soils properties

Ca2+=230.58+214.64 OM －37.26 无机磷菌0.999玉米PO3－4 =0.045+1.98 Al-P+1.05 Fe-P －0.07 TF 1.000 F－ = －1.36+0.29 Olsen-P －9.88 Fe-P －2.60 Al-P 1.000 Ca2+= －47.13+171.93 OM+3.30 无机磷菌0.998烟草PO3－4 =0.878+2.05 Al-P －0.062 有机磷菌 +0.017 有机磷菌解磷量 1.000 F－ =3.32+4.10 OM+1.16 有机磷菌解磷量 － 0.72 无机磷菌0.998

3 结论

(1)采用磷矿石、废土石和对照土栽培烟草和玉米，获得的根际土壤中可溶性F－、P－和Ca2+含量均比非根际和空白土壤显著升高.经过简单复垦，磷矿废弃地磷污染物更易被淋溶释放出来，这种方式对废土石的影响最大，可使磷污染物释放量增加2倍.磷矿废弃地主要是废土石，对其进行简单复垦将使污染加重，必须采取有效控制污染的生态修复方式.

(2)种植烟草和玉米的根际土壤中无机磷细菌和有机磷细菌数量分别比非根际土壤提高1和2个数量级.微生物作用对矿石磷的释放量增加起主要作用.3种磷矿石中解磷菌对无机磷和有机磷的分解能力均大于废土石和对照土壤.由于磷矿石具有较高的磷含量，微生物长期作用将会使稳定的矿物相磷转化为可溶态磷，增加其分解风险和污染物的释放量.

(3)土壤Ca、P和F的释放量受土壤生物理化因子决定.钙的释放不受作物类型的影响，可作为矿石分解程度的指示元素.土壤PO34－的释放主要受土壤Al-P含量的控制.通过对土壤生物理化因子分析，得到磷污染物的潜在释放水平，并针对磷的矿物相组分分布特征，制定废弃地生态修复方案.

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THE EFFECT OF SIMPLE RECLAMATION ACTIVITY ON PHOSPHORUS RELEASE FROM PHOSPHORITE MINED LAND

SHEN Linzi1，2FENG Muhua1LI Wenchao1WANG Chao2
(1.State Key Laboratory of Lake and Environment，Nanjing Institute of Geography ＆ Limnology，Chinese Academy of Sciences，Nanjing，210008，China;2.College of Environment Science and Engineering，HoHai University，Nanjing，210098，China)

The study used laboratory culture experiment to characterize the mechanism of element release from phosphated mined lands after simple reclamation.Tobacco and maize were cultured in the phosphorites，overburden and reference soil.The concentrations of dissolved P－，F－and Ca2+in tobacco and maize rhizosphere soils increased significantly(P ＜0.05)compared with those of nonrhizosphere soils and bulk soils.The amount of phosphorus solubilizing bacteria increased 10—100 times over that of nonrhizosphere soils.The dissolution of Ca2+was independent of plants，and was used to indicate the degree of mineral dissolution.Soil P release was likely controlled by Al-P compounds.The release of F－related closely to the dissolution of P－and Ca2+.The results showed that the amount of released elements from overburden soil was the largest among the five soils after simple reclamation，while the phosphorites had higher potential risk of dissolution.

phosphorus pollution，phosphorus solubilizing bacteria，phosphorite mined land.

2009年12月31日收稿.

*云南省社会发展基础研究重点项目(2009CC025);自然科学基金项目(40603023);中国科学院南京地理与湖泊研究所所长基金(0600211001).

＊＊通讯联系人，Tel:025-86882112，E-mail:mhfeng@niglas.ac.cn