陈仁菊，郭丹丹，肖凯军

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州，510640)

脉冲强磁场对牛奶中酶活性的影响*

陈仁菊，郭丹丹，肖凯军

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州，510640)

研究了脉冲强磁场对牛乳中过氧化物酶、脂肪酶、过氧化氢酶的钝化效果。结果表明，脉冲强磁场对以上3种酶均有很好的钝化效果，且钝化作用的顺序由强到弱为:过氧化氢酶＞脂肪酶＞乳过氧化物酶;当磁场强度在8.01～18.69T、脉冲数在0～10内，以上3种酶的失活率最大值分别为:乳过氧化物酶47.5%，脂肪酶53.6%，过氧化氢酶90.3%。通过二元回归分析的方法建立了以磁场强度、脉冲数为影响因素的，与酶失活率相关的回归方程，并检验了模型的可靠性，结果表明:脉冲数和脉冲磁场强度对以上3种酶的钝化效果都存在显著影响，而且脉冲磁场的强度和脉冲数对牛乳中脂肪酶的钝化效果存在一定的协同效应。文中提供了一种牛乳预处理的新技术，并初步探讨了脉冲强磁场对牛乳中酶的钝化机理，为脉冲强磁场在液体食品中杀菌以及钝酶方面的研究以及工业化生产提供了很好的理论依据。

脉冲强磁场，牛奶，乳过氧化物酶，脂肪酶，过氧化氢酶

传统上往往通过热处理的方法杀灭牛奶中的微生物和钝化部分酶以达到优化乳品感官及质量。但热处理容易对牛奶的品质造成一定影响，如产生蒸煮味等，而且会破坏牛奶中的营养成分［1］。低温下牛奶灭酶技术弥补了热处理的不足，成为国内外学者研究的热点。脉冲磁场技术是利用高强度磁场发生器向螺旋线圈发出强脉冲磁场，将食品放置于螺旋线圈内部的磁场当中，微生物受到强脉冲磁场的作用会死亡，该技术具有保护食品的组织结构、营养成分和颜色不受破坏，保持食品原有风味的优点［2］，目前已在液态食品杀菌、钝化酶活力、提高果汁出汁率等方面得到了广泛研究［3］。马海乐等［4－5］曾对脉冲磁场对辣根过氧化物酶活性的影响、草莓汁过氧化物酶活性的影响进行研究，结果表明低强度脉冲磁场对过氧化氢酶有激活作用，高强度磁场对过氧化氢酶有抑制作用。

本文主要研究脉冲强磁场感应强度在8T以上，10个脉冲以内的处理条件下处理牛奶，了解其中的乳过氧化物酶、脂肪酶、过氧化氢酶的钝化作用。并通过回归分析方法建立数学模型，进一步分析了脉冲强磁场强度及脉冲数对牛乳中3种酶的活性的影响。

1 材料与设备

1.1 实验材料

牛奶，购自华南农业大学牛奶场，于4℃下冷藏。其他化学试剂主要购自天津化学试剂厂和广州化学试剂厂，所用化学试剂均为分析纯。

1.2 实验装置

HSM－S20型脉冲强磁场装置，武汉强磁场中心。

2 实验方法

2.1 牛奶中粗制酶液的提取

将牛奶于4℃，7 000 r/min下离心10 min，除去乳脂肪，再经抽滤除去大的脂肪球。将滤液用磷酸调节pH至4.6，混合均匀，沉淀酪蛋白，然后用双层纱布过滤，滤液置于高速冷冻离心机中，4℃，8 000 r/min离心15 min，上清液用0.5mol/L的NaOH溶液调pH值至6.0，即得到粗制酶液，于4℃下保存［6］。虽然样品中含有部分乳清蛋白会影响酶测定的准确性，但目前关于牛乳中酶的测定中大多数以此方法制备样品，改进后的样品制备方法是先通过离心去掉乳清，再将得到的酶蛋白的胶粒进行一定的处理后测定。但由于酶是存在于牛乳中才能更好地发挥作用，因此张爱霞［10］等人认为传统制备样品的方法更利于实际研究。

2.2 脉冲强磁场处理粗制酶液

将粗制酶液分装入不同试管中，盖上塞子，室温放置1 h，标号，并对粗制酶液分别进行脉冲强磁场处理。选择磁场强度和脉冲数作为影响因素，磁场强度分别为:8.01T、10.68T、13.35T、16.02T、18.69T(对应的电压分别为 3、4、5、6、7 kV)，每个磁场强度分别设置2、4、6、8、10五个水平的脉冲数，共25组试验。脉冲宽度为10 ms，脉冲之间的间隔为15 s。

2.3 乳过氧化物酶活性的测定

2.3.1 溶液的配制

(1)磷酸盐缓冲液(pH值7.0):用0.2mol/L的Na2HPO4溶液将100mL，0.2mol/L KH2PO4溶液的pH值调至7.0。

(2)过氧化氢溶液:用蒸馏水将1.0mL过氧化氢(30%H2O2)定容至100mL，取出1.0mL，并用磷酸缓冲液将它稀释至50mL。

(3)4-氨基安替比林溶液:取810 mg苯酚溶于40mL蒸馏水中，加25 mg 4-氨基安替比林，溶解，用蒸馏水定容至50mL。

2.3.2 过氧化物酶活性的测定

采用沃辛通法测定过氧化物酶活性［7］。将1.4mL 4-氨基安替比林溶液和1.5mL过氧化氢溶液滴入一只1cm比色皿，并调温至25℃。加0.10mL酶溶液，混合，按动秒表，用紫外可见分光光度计(510 nm)以蒸馏水为参比测定吸光度(在5 min内每隔1 min测1次)，直至每分钟内吸光度的增大值达到稳定为止。

乳过氧化物酶活力的计算:1个乳过氧化物酶单位相当于在规定条件下，于25℃，pH7.0时，每分钟分解1 mol H2O2时所需的酶量。计算公式为:

式中:酶活力单位为U/mg。E510为510 nm处每分钟吸光度的增大值;3为反应混合液的总体积;EW为每0.1mL所用酶液中含酶的质量(mg);6.58为1个单位能在1 min内使吸光度增大6.58。

2.4 脂肪酶活性的测定

脂肪酶活性的测定参考张瑞宇等的方法［8］。制作底物溶液:称取聚乙烯醇(PVA)40 g，加水800mL，在沸水浴中加热，搅拌，直至全部溶解，冷却后定容至1 000mL。以干净的双层纱布过滤，滤液即为4%的PVA溶液。量取4%PVA溶液150mL，加橄榄油50mL，用均质机处理6 min(分2次处理，每次3 min，中间停5 min)，即成乳白色PVA乳化液。溶液最好现用现配，如贮存在冰箱中，有效期为1周。

测试脂肪酶活性:取2个100mL三角瓶，分别于空白瓶和样品瓶中各添加4mL底物溶液和5mL磷酸缓冲液(pH=7.5，0.025mol/L)，再于空白瓶中加入15mL 95%乙醇，将2瓶置于(40±0.2)℃水浴预热5 min，各加入待测酶液1mL，立刻混匀，计时，在(40±0.2)℃水浴中准确反应15 min，在样品瓶中补加15mL 95%乙醇终止反应，取出。在空白瓶和样品瓶中各加1%酚酞指示剂3滴，用0.01mol/L NaPH标准溶液滴定，直至微红色并保持30 s不褪色，即为终点。记录消耗NaPH标准溶液的体积。计算公式为:

式中:X为样品的酶活力，u/g;B为样品滴定时消耗的NaOH标准溶液的体积，mL;A为空白滴定时消耗NaOH标准溶液的体积，mL;c为NaOH标准溶液的浓度，mol/L;0.05为NaOH标准溶液浓度换算系数;50为0.05mol/L NaOH溶液1.00mL相当于脂肪酸50 μmol;1/15为反应时间15 min，以1 min计;n为稀释倍数。

2.5 过氧化氢酶活性的测定

用碘量滴定法测定过氧化氢酶的活性［9］。

淀粉指示剂:取0.3 g可溶性淀粉与少量水混合，倒入沸水中，冷却后加0.1 g KI和0.1 g Na2CO3，用水稀释至50mL。

将0.1mL 30%H2O2用 0.01mol/L、pH6.8的磷酸缓冲液稀释至100mL，即得到测定过氧化氢酶的底物溶液。取5mL底物溶液于100mL的碘量瓶中，置于25℃水浴中保温。向其中加入1mL粗制酶液，立刻计时，混匀。3 min后立即加入2mL 0.5mol/L的H2SO4灭酶。再加入1mL 10%的KI和2滴1%的钼酸铵溶液，放置3 min后，用0.01mol/L的硫代硫酸钠溶液滴定，待反应液呈浅黄色时，加2～3滴淀粉碘化钾指示剂，继续滴定至蓝色消失为止。记录硫代硫酸钠溶液消耗的体积(mL)。对照先加H2SO4后加酶液，其余步骤与上述操作相同，记录消耗硫代硫酸钠溶液的体积(mL)。

本实验条件下，每分钟催化分解1μg H2O2的酶量定义为1个活力单位。绝对酶活力(U/mL或U/g)的计算公式为:

式中:A为空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积，mL;B为样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积，mL;c为硫代硫酸钠溶液的浓度，mol/L;1 000为硫代硫酸钠溶液的摩尔数折合成微摩尔数;3为反应3时间，min;n为酶液的稀释倍数。

2.6 脉冲强磁场对牛奶中酶作用的评价

脉冲强磁场对牛奶中酶活性的影响用酶失活率进行评价。酶失活率的计算公式为:

2.7 数学模型验证

用Excel软件进行二元回归分析，建立与酶的失活率相关的脉冲数和脉冲磁场强度的二元回归方程。其中脉冲磁场的强度分别为:8.01T、10.68T、13.35T、16.02T、18.69T;脉冲数分别为:2、4、6、8、10。通过对回归系数的显著性水平P值以及方程的复相关系数R值等的分析，进一步分析模型的准确性。以得出在实际应用中控制酶失活率在一定范围内时，脉冲磁场强度与脉冲数的最佳参数设定。

3 结果与分析

3.1 脉冲强磁场对牛奶中过氧化物酶的作用

3.1.1 磁场强度对牛奶中乳过氧化物酶活性的影响

由图1可以看出，脉冲强磁场的磁场强度对牛奶中乳过氧化物酶活性的影响趋势。整体来看，随着磁场强度的增大，脉冲磁场对牛奶中乳过氧化物酶的钝化作用呈线性不断增强。而且结合图2分析可以得出，随着脉冲数的增多，脉冲磁场对乳过氧化物酶的钝化效率不断提高。而且当脉冲数为10，磁场强度在8.01～13.35T，乳过氧化物酶的失活率升高最快，当磁场强度高于13.35T，乳过氧化物酶的失活率变化趋势又趋于平缓。

图1 磁场强度对牛奶中乳过氧化物酶活性的影响

这个趋势与高梦祥等人关于在脉冲强磁场对酶的钝化效果方面的实验结果是一致的［1，4］。随着磁场强度的增强和脉冲数的增多，钝化作用越来越强，这种趋势也适用于下文各部分的分析。关于脉冲磁场对酶的作用效果的机理解释目前仍无定论，贺华君等人［11］认为是脉冲强磁场改变了酶的活性中心立体构象从而导致酶失活。

3.1.2 脉冲数对牛奶中乳过氧化物酶的作用

由图2可以看出，脉冲数对牛奶中乳过氧化物酶活性的影响总体趋势为，随着脉冲数的增加，脉冲磁场对乳过氧化物酶的钝化作用不断增强。当磁场强度为18.69T时，仅需2个脉冲，乳过氧化物酶的失活率即可达到26.5%，但4个脉冲以后，乳过氧化物酶的失活率的变化又趋于平缓，当脉冲数达到10时，乳过氧化物酶的失活率可达到47.5%。这可能是由于酶活性在较高场强下，随脉冲数的增多，钝化作用效果的增强受到一定的抑制而变得不那么明显。

图2 脉冲数对牛奶中乳过氧化物酶活性的影响

整体来看，在脉冲数为10，磁场强度在8.01～13.35T，脉冲强磁场对过氧化物酶的作用效果十分稳定。有必要通过增加脉冲数和感应强度来进一步研究脉冲磁场对过氧化氢物酶的钝化作用。

3.2 脉冲强磁场对牛奶中脂肪酶的作用

3.2.1 磁场强度对牛奶中脂肪酶的作用

图3中表示脉冲强磁场的磁场强度对牛奶中脂肪酶活性的影响趋势，可以看出，随着磁场强度的增大，脉冲磁场对牛奶中脂肪酶的钝化作用不断增强。在2个脉冲条件下，脂肪酶的失活率随磁场强度增大的变化趋势最为平缓，但不稳定。6个脉冲条件下，随着磁场强度的增大，脂肪酶的失活率升高趋势比2个脉冲条件下的升高趋势明显，脂肪酶的失活率由8.01T时的13.4%升高到18.69T时的53.6%。10个脉冲条件下，脂肪酶的失活率变化趋势较为平滑，基本呈线性，比6个脉冲条件下脂肪酶的失活率变化幅度略有减小。牛乳中脂肪酶失活随脉冲数和磁场强度的变化呈现一定的波动性，这是因为这两个因素对脂肪酶的钝化效果可能存在一定的协同效应，这在下文4.3部分的二元回归分析中得到了证实。

图3 磁场强度对牛奶中脂肪酶活性的影响

3.2.2 脉冲数对牛奶中脂肪酶的作用

由图4可以看出，脉冲数对牛奶中脂肪酶活性的影响总体趋势为，随着脉冲数的增加，脉冲磁场对脂肪酶的钝化作用不断增强。在磁场强度为8.01T时，脂肪酶的失活率随脉冲数的增多而升高的趋势最为平缓，10个脉冲时的失活率为13.4%。磁场强度为13.35T的条件下，脂肪酶的失活率随脉冲数增多而升高的趋势居中，脉冲数较小时变化幅度较大，脉冲数增大，变化趋势有所平缓。当磁场强度为18.69T时，仅需2个脉冲，脂肪酶的失活率即可达到28.8%，但随着脉冲数的增加，脂肪酶的失活率的变化又趋于平缓。

图4 脉冲数对牛奶中脂肪酶活性的影响

分析图4和图5得出，脂肪酶失活率的变化随脉冲数的增多而呈现出一定的波动性，在脉冲数为10时，随磁场强度的增强，脂肪酶的钝化效果比较均匀;而且在脉冲数为10，磁场强度为18.69T时，牛乳中脂肪酶的失活率可达到90%以上。

3.3 脉冲强磁场对牛奶中过氧化氢酶的作用

3.3.1 磁场强度对牛奶中过氧化氢酶的作用

由图5可以看出，随着磁场强度的增大，牛奶中过氧化氢酶的失活率提高。在2个脉冲条件下，过氧化氢酶的失活率磁场强度升高的变化幅度最小，过氧化氢酶的失活率仅由8.01T的12.1%提高到18.9T的45.2%。6个脉冲时，过氧化氢酶的失活率随磁场强度升高的变化幅度大于2个脉冲条件下过氧化氢酶失活率的变化幅度。而10个脉冲条件下，过氧化氢酶的失活率随磁场强度升高的变化幅度最为明显，由8.01T的29.7%%升高到18.9T时的90.3%。

图5 磁场强度对牛奶中过氧化氢酶活性的影响

3.3.2 脉冲数对牛奶中过氧化氢酶的作用

图6表示脉冲强磁场的脉冲数对牛奶中过氧化氢酶活性的影响趋势，整体来看，随着脉冲数的增大，牛奶中过氧化氢酶的失活率不断提高。在8.01T的磁场强度时，过氧化氢酶的失活率随脉冲数升高的变化幅度最小。当磁场强度为13.35T时，过氧化氢酶的失活率随脉冲数增多的变化幅度大于8.01T磁场强度条件下过氧化氢酶失活率的变化幅度。而当脉冲磁场的磁场强度为18.69T时，过氧化氢酶的失活率随磁场强度升高的变化幅度最为明显，变化幅度均大于8.01T和13.35T时的过氧化氢酶失活率的变化幅度。

图6 脉冲数对牛奶中过氧化氢酶活性的影响

通过图5和图6的分析可以得出，在脉冲数为8时，随着磁场场强度的增强，牛奶中过氧化氢酶的失活率比较均匀，而且在磁场强度为13.35时，失活率就可以达到50%左右。这可以作为生产中的重要依据。

4 二元回归分析模型的建立

令Yn为对应的酶的失活率，X1为脉冲数，X2为脉冲磁场强度。

4.1 磁场强度和脉冲数对牛乳中过氧化物酶的钝化效果的二元回归分析

牛乳中过氧化物酶失活率

其中方差分析结果如表1所示。

表1 过氧化物酶失活率的回归方程的系数显著性检验

由方差分析的结果可以看出，显著性水平P值均为0，说明脉冲强磁场的强度和脉冲数对过氧化物酶的钝化效果的影响均非常显著。而回归模型方差分析结果如表2所示。

表2 过氧化物酶失活率回归模型方差分析

F＞F0.05，说明方程显著。R=0.97，说明此模型与真实值符合程度达到97%，非常接近准确值，说明可以用此模型来分析脉冲强磁场处理后，过氧化物酶失活率对应的脉冲磁场强度和脉冲数。

4.2 磁场强度和脉冲数对牛乳中过氧化氢酶的钝化效果二元回归分析

牛乳中过氧化氢酶失活率用下列函数表示:Y2=－15.03+3.86X1+2.66X2。

各因素对过氧化氢酶的失活率的影响显著程度见表3。

表3 过氧化氢酶失活率的回归方程的系数显著性检验

分析方法见4.1。其中脉冲数对乳过氧化氢酶的影响系数为3.86，影响程度大于磁场的强度(系数2.66)。

表4 过氧化氢酶失活率回归模型方差分析

F＞F0.05，说明方程显著。R=0.72，说明此模型与真实值符合程度达到72%，但仍可以用此模型来初步预测脉冲强磁场处理后，过氧化氢酶失活率对应的脉冲磁场强度和脉冲数。

4.3 磁场强度和脉冲数对牛乳中脂肪酶的钝化效果的二元回归分析

牛乳中脂肪酶的失活率可用以下函数表示:Y3=－26.14+3.58X1－0.26X12+1.91X2+0.025X22+0.15X1X2。分析结果如表5所示。

表5 脂肪酶失活率的回归方程的系数显著性检验

分析方法参考4.1。这个模型与4.1不同之处在于引入了X1X2以及X12和X22三个变量值，目的主要在于分析脉冲数与脉冲磁场强度对乳脂肪酶是否存在协同作用效果。由表5可知，X1X2项的P值为0.001＜0.05，说明脉冲娄和磁场强度牛乳中脂肪酶的钝化作用存在显著的协同效应，但系数是0.15，说明协同作用的效果不是十分明显。而X2对应的P值为0.4＞0.1，说明这个变量对模型的影响不是十分显著，可以剔除，因此，修正后牛乳中脂肪酶失活率的回归模型用下列函数表示:Y3=－26.14+3.58X1－0.26X12+1.91X2+0.15X1X2。

F＞F0.05，说明方程显著。R=0.72，说明此模型与真实值符合程度达到99.4%，完全可以认定为准确值，因此可用此模型来分析脉冲强磁场处理后，脂肪酶失活率对应的脉冲磁场强度和脉冲数。

表6 脂肪酶失活率回归模型方差分析

综合以上回归模型的分析可以得出，脉冲强磁场对本文中3种酶钝化作用强弱的顺序为:过氧化氢酶＞脂肪酶＞过氧化物酶。

5 结论与讨论

(1)脉冲强磁场对乳过氧化物酶、脂肪酶钝化作用的变化规律用数学模型来表示分别为:Y1=－29.7+1.72X1+3.02X2，Y2=－15.03+3.86X1+2.66X2，Y3= －26.14+3.58X1－0.26X12+1.91X2+0.15X1X2。脉冲强磁场对过氧化物酶和过氧化氢酶的钝化作用效果的回归模型呈线性分布，而对于牛乳中脂肪酶，脉冲磁场强度与脉冲数存在显著的协同效应，呈二次分布。脉冲强磁场对牛奶中乳过氧化物酶、脂肪酶、过氧化氢酶均有显著的钝化作用，且脉冲强磁场对3种酶钝化作用强弱的顺序为:过氧化氢酶＞脂肪酶＞乳过氧化物酶。脉冲磁场对不同酶的作用效果的差异性也间接说明了其作用机理的复杂性。

(2)磁场强度在8.01～18.69T、脉冲数在0～10，对牛奶中乳过氧化物酶的失活率可达到47.5%，对脂肪酶的失活率可达到53.6%，对过氧化氢酶的失活率可以达到90.3%。综合考虑实际生产的需要以及工艺的可行性，可以根据以上二元回归分析的函数建立方程组来解出所需参数。随着技术的进步以及研究的进一步深入，流动条件下通过脉冲强磁场对牛乳进行预处理，达到钝化牛乳中各种酶的活性，杀灭有害微生物以提高牛乳保质期和保持牛乳的感官品品质有良好的工业前景。

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Effect of Pulsed High Magnetic Field on the Enzyme Activity of Milk

Chen Ren-ju，Guo Dan-dan，Xiao Kai-jun
(South China University of Technology，College of Light Industry and Food sciences，Guangzhou 510640，China)

The effect of Pulsed High Magnetic Field(PHMF)on milk peroxidase，lipase，catalase of milk was studied in this paper.And the results showed that:PHMF has great effect on the inactivation of enzymes mentioned above，and the order of the inactivation effect on the three enzymes was:Catalase＞ Lipase＞ milk peroxidase.The max inactivation rate of milk peroxidase，Lipase and Catalase is 47.5%，53.6%and 90.3%respectively under the condition o8.01T～18.69T magnetic field intensity，0～10 pulsed numbers.Regression equations about the enzyme inactivation effect were set up through the binary regression analysis method.The influencing factors of these models were magnetic field intensity and pulse count.The reliability of the models were tested.The results showed the following:the magnetic field intensity and pulse numbers have significant influence on the enzymes mentioned above，and more over，these factors have synergy effect on lipase.This paper provided a new method for milk pretreatment，and discussed the mechanism of PHMF on enzymes in milk.The research of this paper has important significance for the liquid food sterilization and enzyme inactivation.It also provides a theoretical basis in the related field of industrialized production.

pulsed high magnetic field，inactivation，milk peroxidase，lipase，catalase

硕士研究生。

*国家863计划项目(编号:2007AA100405)，项目介绍:课题名称为食品非热加工技术与设备，属于农业生物制造与食品精细加工技术及产品项目

2010－07－26，改回日期:2010－09－06