龚东平，胡耀池，张红漫，陈园力

1(南京工业大学生物与制药工程学院，材料化学工程国家重点实验室，江苏南京，210009)2(南京工业大学理学院，江苏南京，210009)

游离脂肪酸对DHA油脂氧化稳定性的影响*

龚东平1，胡耀池1，张红漫2，陈园力1

1(南京工业大学生物与制药工程学院，材料化学工程国家重点实验室，江苏南京，210009)2(南京工业大学理学院，江苏南京，210009)

针对游离脂肪酸(FFA)对裂殖弧菌DHA油脂的氧化稳定性进行了研究。通过向纯化后的DHA油脂中加入短、中、长3种不同碳链的FFA，采用Schaal烘箱法加速氧化，以过氧化值POV(一级氧化指标)和硫代巴比妥酸反应物TBRAS(二级氧化指标)表征油脂氧化情况。结果表明:加入FFA后DHA油脂的氧化稳定性降低，由此得出游离脂肪酸对DHA油脂氧化有促进作用;经加入烷烃作对照，初步证实了FFA的促氧化作用与其羧基有关。

DHA油脂，游离脂肪酸，氧化稳定性，促氧化

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)是一种重要的n-3长链多不饱和脂肪酸，俗称脑黄金，具有增强记忆，促进智力和视力发育，降低血脂，调节免疫系统等功效，因此在婴幼儿配方食品及保健品中添加DHA越来越受到重视［1－2］。但因DHA油脂具有高不饱和度，生产应用中极易氧化产生异腥味，影响食品的感官品质及营养价值［3］。目前DHA油脂的抗氧化研究多集中在天然抗氧化剂的筛选及其微胶囊包埋方面上，对DHA油脂中的微组分对其氧化稳定性的影响研究较少。精炼后的可食用油脂中的微组分(亦即非甘三酯)通常包含色素(类胡萝卜素及叶绿素)、酚类、游离脂肪酸(FFA)、磷脂、过氧化物、甾醇、甘一(二)酯中的几种，占油脂的5%左右，这些微组分对油脂具有抗氧化或促氧化效应［4］。精炼后的DHA油脂中的酸价AV在0.1～0.5 mg/g，而FFA的存在对DHA精油的氧化稳定性的影响仍未知。本研究采用多层填料柱层析柱去除DHA油脂中的微组分，然后外加FFA，采用Schaal烘箱法加速氧化，通过测定过氧化值POV和硫代巴比妥酸反应物TBRAS，探讨了FFA的种类及添加量对DHA油脂的氧化稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

精炼DHA油脂:不添加任何抗氧化剂，江苏天凯生物科技有限公司;粗孔硅胶:100～200目，青岛海洋化工厂;活性炭，南京佳力活性炭厂;硅藻土545，阿拉丁;羊脂酸、豆蔻酸、硬脂酸、正辛烷均为GC级;其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

GZX-9140电热鼓风干燥，上海博迅实业有限公司;Lamada-25紫外/可见分光光度计，PerkinElmer公司;恒温水浴锅;真空旋转蒸发仪。

1.3 试验方法

1.3.1 多层填料柱层析去除DHA油脂中的微组分

本研究采用4层填料层析柱去除DHA油脂中的微组分［5］。在一根层析柱(4cm i.d×60cm)中依次填入活化后的硅胶50 g，m(活性碳)∶m(硅藻土545)=1∶2混合物45 g，m(硅藻土545)∶m(蔗糖)=1∶2混合物45 g，活化硅胶50 g。4层填料均浸泡在正己烷中采用湿法装柱，并通过三通阀连接双联球压实。走样前用正己烷反复洗柱直至洗脱液的过氧化值为0。取一定质量的DHA油脂溶于等体积的正己烷中，注入层析柱后纯氮加压(0.1 MPa)收集洗脱液直至洗脱液滴在滤纸上无油迹。洗脱液30℃下真空旋转回收正己烷，痕量正己烷通过鼓入纯氮去除。所得纯化油样置于－80℃中保存待分析。

1.3.2 DHA油脂的微组分分析

经柱层析纯化后的 DHA油脂，按照 GB/T5009.37－2003测定DHA油脂的过氧化值(POV)及酸价(AV);按照GB/T 5009.181－2003测定DHA油脂的硫代巴比妥酸反应物(TBRAS)，结果以丙二醛(MA)计，μg MA/g;采用甲醇萃取油脂中的酚类物质并通过福林酚比色法［7］测定DHA油脂中的总酚的含量，结果以没食子酸(GAE)计，μg GAE/g;按照GB/T 5537－2008测定DHA油脂中的总磷脂含量;将DHA油脂溶于6倍体积的正己烷后，采用全波长扫描法［6］通过吸光值来表征油脂的色素含量。

1.3.3 DHA油脂的加速氧化实验

用纯化后的DHA油脂分别配制含羊脂酸(C8:0)、豆蔻酸(C14:0)、硬脂酸(C18:0)的油样，每种油样中FFA的添加量均设置0.2%、0.4%、0.8%3个水平，并以空白油样做对照，混匀后各取40 g置入100mL烧杯中，盖上表面皿，采用 Schaal烘箱法［8］于(40±1)℃下避光加速氧化。

1.3.4 DHA油脂氧化程度的评价方法

脂质初级氧化产生氢过氧化物ROOH，继续氧化ROOH会分解成许多小分子混合物，如醛、酮、烃、醇等［9］。本研究通过测定过氧化值POV表征油脂一级氧化情况;采用TBRAS法测定油脂中的丙二醛(MA)表征其二级氧化情况;同时测定酸价AV表征DHA油脂中酸性产物的含量。

2 结果与分析

2.1 柱层析纯化前后DHA油脂的微组分分析

多层填料柱层析法是一种纯化油脂得到甘三酯的方法，采用此法去除DHA油脂中的微组分后其物化性质变化如表1所示。从表1可知，柱层析后DHA油脂的POV降低90%，TBARS降低94%，酸价AV降为0，表明多层填料层析柱对DHA油脂的氧化产物及游离脂肪酸有很好的吸附作用;因本研究所用DHA油样经过高度精炼，故磷脂未检出;具有抗氧化作用的酚类物质，由柱层析前的(5.78±0.41)μg GAE/g降低为(1.15±0.099)μg GAE/g。因类胡萝卜素的主要吸收波长在430～460 nm，叶绿素及其衍生物的吸收波长在550～710 nm［6］，紫外全波长扫描显示(图1):DHA油脂的色素主要为类胡萝卜素;经过柱层析分离后，类胡萝卜素得以有效去除，430 nm处DHA油脂的吸光值由层析前的0.330降至0.041(表1)，故纯化后的油脂清澈并接近无色。本研究通过柱层析纯化DHA油脂，消除了其他微组分对DHA油脂氧化稳定性的影响。

表1 柱层析纯化前后DHA油脂的物化性质

图1 纯化前后DHA油脂/正己烷(体积比1∶6)混合液全波长扫描图

2.2 FFA对DHA油脂过氧化值POV的影响

脂质氧化的初期，一级氧化产物ROOH的生成速率远远大于其分解速率，因而可以通过测定POV来评价油脂的氧化程度［9］。在纯化后的DHA油脂中添加3种不同碳链的FFA后，其POV在40℃加速氧化下的变化趋势如图2所示。

图2 FFA对DHA油脂的过氧化值POV影响

从图2(A)可知，添加了羊脂酸(C8∶0)的DHA油脂的POV比对照要高(P＜0.05)，并且随着羊脂酸添加量的增加，POV也随之显著增加(P＜0.05)，由此得出羊脂酸对DHA油脂有促氧化作用;图2(B)中，添加了豆蔻酸(C14:0)的DHA油脂出现了与图2(A)同样的POV上升趋势，亦即豆蔻酸同样对DHA油脂有促氧化作用;图2(C)中，添加了0.2%硬脂酸(C18∶0)的DHA油脂的POV变化与对照并无显著性差异(P＞0.05)，并且随着硬脂酸(C18∶0)添加量的增加，POV并没随之明显增加(P＞0.05);但与对照相比，添加了高水平硬脂酸(0.8%)的DHA油脂其POV明显增高(P＜0.05)，由此得出，长碳链的硬脂酸(C18∶0)对DHA油脂也有促氧化作用，但在低水平下，其促氧化作用并不明显;从图2(D)中POV的变化可知，同一添加量下(0.8%)，低碳链的羊脂酸(C8∶0)对DHA油脂的促氧化作用最强，中碳链的豆蔻酸(C14:0)促氧化作用居中，长碳链的硬脂酸(C18∶0)最弱(P＜0.05)。原因可能在于相同的质量添加分数下，碳链越短，分子质量越小，所加入的FFA分子数越多，因而促氧化作用越强。

2.3 FFA对DHA油脂TBARS的影响

从图3可以看出，随着加速氧化时间的延长，DHA油脂的TBARS值在不断升高，说明DHA油脂中的二级氧化产物-醛类物质在不断增加。

图3 FFA对DHA油脂TBARS的影响

图3(A)中，添加了不同浓度的羊脂酸(C8∶0)的DHA油脂与空白比较，TBARS值均有所上升(P＜0.05)，并且TBARS值随着羊脂酸(C8∶0)的添加量的增加而上升(P＜0.05)，此变化趋势与图1(A)中的POV变化趋势相似;图3(B)显示，相同的添加量下(0.8%)，FFA碳链越短，所对应的DHA油脂中的TBARS越高(P＜0.05)，与图1(D)的POV变化趋势亦相似;TBARS作为油脂的二级氧化指标，进一步证明了FFA分子对DHA油脂有促氧化作用。

2.4 FFA对DHA油脂的酸价AV的影响

测定油脂的酸价AV实际上是检测油脂中的FFA及酸性氧化产物的多少。从图4中可以看出，40℃下加速氧化时空白油样的酸价有微弱的增加，而添加了3种FFA的DHA油脂的酸价并没有明显的变化(P＞0.05)，说明40℃加速氧化条件下，所添加的FFA并没有促使DHA油脂中的酯键水解生成更多的游离脂肪酸;同时也说明添加FFA后，DHA油脂氧化生成二级酸性氧化产物的过程，可能受到了外加的FFA的抑制作用或者反应处于动态平衡中。

图4 FFA对DHA油脂酸价AV的影响

2.5 正辛烷与羊脂酸对DHA油脂氧化稳定性的影响

图5 正辛烷与羊脂酸对DHA油脂的POV及TBARS的影响

为了验证FFA对DHA油脂的促氧作用是否与其极性的—COOH基团有关，本研究中，将与羊脂酸具有相同碳原子数的正辛烷与羊脂酸按同一摩尔分数(0.07mmol/g)加入到纯化后的DHA油脂中，于40℃下进行加速氧化。从图5(A)可知，加有正辛烷油样的POV与空白油样并无显著差异 (P＞0.05)，而加有羊脂酸油样的POV明显高于空白油样(P＜0.05);与此相同，图5(B)中，加有正辛烷油样的TBARS与空白油样亦无显著差异 (P＞0.05)，而加有羊脂酸油样的TBARS同样明显高于空白油样(P＜0.05);说明不含-COOH基团的正辛烷并不能促进DHA油脂的氢过氧化物ROOH及醛类物质的形成，相反羊脂酸加速DHA油脂氧化的作用明显，从而验证了FFA加速DHA油脂氧化与其极性的—COOH基团有关。

3 结论

去除DHA油脂中的其他微组分后，通过单加FFA发现，不论其碳链长短，在一定的添加水平下，都对DHA油脂有促氧化作用，其促氧机理可能有以下2个方面:(1)FFA分子的极性—COOH基团能够催化脂质氢过氧化物ROOH分解生成自由基，后者可加速脂质自动氧化的链式反应［10］;(2)FFA分子因—COOH呈极性，在高水平下，同甘一(二)酯、磷脂等极性组分一样，易于富集在油脂表层并降低其表面张力，通过吸收空气中的氧分子从而加速油脂氧化［4］。

因此，在DHA油脂的精炼过程中，要尽量减少FFA的含量，避免能够促进中性脂质水解生成FFA的因素;对精炼后含有微量FFA的DHA油脂，要加入能够钝化—COOH催化活性的抗氧化剂，相关的研究工作还将继续。

［1］Horrocks L A，Yeo Y K.Health benefits of docosahexaenoic acid(DHA)［J］.Pharmacol Res，1999，40:211－215.

［2］Connor WE.Importance of n-3 fatty acids in health and disease［J］.Am J Clin Nutr，2000，71:171S－175S.

［3］朱丽娜，张志国，张敏，等.DHA的生理功能及其在食品中的稳定性［J］.中国乳品工业，2009，37(2):45－48.

［4］Akoh C K，Min D B.Food lipids:chemistry，nutrition，and biotechnology［M］.Florida:CRC Press，2008:449－453.

［5］Kulas E，Ackman RG.Protection of α-tocopherol in nonpurified and purified fish oil［J］.J Am Oil Chem Soc，2001，78:197－203.

［6］Abuzaytoun R，Shahidi F.Oxidative stability of flax and hemp oils［J］.J Am Oil Chem Soc，2006，83:855－861.

［7］Abuzaytoun R，Shahidi F.Oxidative stability of algal oils as affected by their minor components［J］.J Agric Food Chem，2006，54(21):8 253－8 260.

［8］朱振宝，田宾，易建华.金银花不同提取物的油脂抗氧化效果研究［J］.食品与发酵工业，2008，34(2):69－72.

［9］李桂华油料油脂检验与分析［M］.北京:化学工业出版社，2006:74－80.

［10］Miyashita K，Takagi T.Study on the oxidative rate and prooxidantactivity of free fatty acids［J］.J Am Oil Chem Soc，1986，63(10):1 380－1 384.

Effect of Free Fatty Acid on the Oxidative Stability of DHA Oil

Gong Dong-ping1，Hu Yao-chi1，Zhang Hong-man2，Chen Yuan-li1
1(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，Nanjing 210009，China)2(College of Science，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China)

The effect of free fatty acid(FFA)on the oxidative stability of DHA oil produced by Schizochytrium sp.Was studied.The oxidation of purified DHA oils added with three kinds of FFA were monitored by measuring peroxide value(POV，index of primary oxidation products)and thiobarbituric acid reactive substances(TBARS，index of secondary oxidation products)under Schaal oven test condition.Results showed that the oxidative stability of purified DHA oils was decreased by adding FFA.With the control of alkane，the pro－oxidant effect of FFA due to its carboxyl groups was initially confirmed.

DHA oil，free fatty acid，oxidative stability，prooxidant

硕士研究生(张红漫为通讯作者)。

*国家自然科学基金重点项目(No.20936002);国家重点基础研究发展计划(973计划)(Nos.2007CB707805，2009CB724700);江苏省六大人才高峰项目(2008);江苏省高校科研成果产业化推进项目(2009)

2010－07－19，改回日期:2010－09－15