曲云淼，董振国

（1.黑龙江省家畜繁育指导站，哈尔滨 150069；2.黑龙江省博瑞遗传有限公司 150069）

猪的克隆和转基因生产为胚胎工程、品种改良以及医学组织工程都提供了新的思路，在诸如异体器官移植和生产一些特定的蛋白质等方面具有广阔的前景。而猪的克隆和转基因生产等都需要大量成熟的、具有发育潜力的卵母细胞[1]。但是由于猪卵母细胞的生理生化特异性，给克隆和转基因研究带来诸多不利因素。因此，需要找到一种理想的猪卵母细胞体外培养方法。影响猪卵母细胞体外成熟的因素有许多，如所处性周期阶段、生长因子的作用等。本实验主要探讨了培养时间，以及在培养基中添加表皮生长因子对卵母细胞成熟的影响。

1 材料与方法

1.1 卵巢的采集和卵泡液的制备

在屠宰场将被屠宰的猪卵巢立即取下，用生理盐水冲洗干净，保存于25～35℃含有青霉素（100IU/mL）和链霉素（100 IU/mL）的生理盐水的保温瓶中，在3 h内运回实验室。用生理盐水配制的70%酒精浸泡1 min，然后再用预热的生理盐水洗涤卵巢至无血水为止，选择排卵点多且直径在2～5 mm卵泡的卵巢，带进无菌实验室。

1.2 卵母细胞的采集和成熟培养

使用配有12号针头的10 mL注射器从2～5 mm卵泡中抽吸卵母细胞，采卵液为TCM-199（Hank's），成熟液为自配成熟液，成份为：TCM-199（Earle's）培养液+0.1%PVA（聚乙烯醇）+3.05 mmol/LD-葡萄糖+0.91 mmol/L丙酮酸钠+75 mg/mL青霉素+50 mg/mL硫酸链霉素，在每次使用之前加入药品：0.57 mmol/L半胱氨酸，0.5 IU/mL LH，0.5 IU/mL FSH，10μg/mL EGF（表皮生长因子）。将成熟液在培养皿中作成50 μL的微滴，将卵母细胞放入成熟滴在5%CO2、38.5℃、饱和湿度的CO2培养箱中培养44 h。

2 结果与分析

2.1 EGF浓度对猪卵母细胞体外成熟的影响

在自配成熟液作为对照组，分别添加10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL EGF 的成熟液培养COCs（卵丘-卵母细胞复合体），放入5%CO2、38.5℃、饱和湿度的CO2培养箱中培养44 h后，观察卵母细胞成熟率。

表1 EGF浓度对猪卵母细胞体外成熟的影响

由表1可以看出，添加EGF各组与对照组相比，成熟率都显著提高，差异显著。添加EGF各组的成熟率随着EGF添加浓度的增加也不断上升。

2.2 不同成熟时间对猪卵母细胞体外成熟的影响

将采集到的可用卵母细胞放入5%CO2、38.5℃、饱和湿度的相同培养条件下分别进行体外成熟培养，培养时间分别为36 h、40 h、44 h和48 h，观察卵母细胞成熟率。

由表2可以看出，随着成熟时间的增长，成熟率逐渐增加。

表2 不同培养时间对猪卵母细胞体外成熟的影响

3 讨论

3.1 EGF浓度对猪卵母细胞体外成熟的影响

EGF是一种活性物质，由53个氨基组成，通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质[1]。Carpenter等报道，它对不同哺乳动物细胞体外培养时都具有很强的促分裂作用。EGF不但能促进卵母细胞减数分裂，也间接调节卵母细胞胞浆的成熟。EGF可以促进卵丘细胞扩张、减少缝隙连接，抑制颗粒细胞合成卵母细胞成熟抑制物（OMI）的作用，促进卵母细胞成熟[2]，也可以参与并促进细胞内的DNA、RNA、蛋白质以及细胞外大分子的生物合成。EGF通过与细胞膜上的EGF受体（EGFR）结合，启动、催化、维持与细胞生长增殖有关的一系列生化过程。EGF的作用机理可能是与释放成熟刺激信号阻断了卵母细胞与卵丘细胞的联系有关，也可能其直接对卵母细胞产生作用。本实验结果显示，所有添加EGF试验组的成熟率随着添加量的增加而不断上升，并且均要高于未添加EGF的试验组，差异显著。

3.2 不同培养时间对猪卵母细胞体外成熟的影响

由于动物的种属差异和个体差异，其体外培养的时间上也是有所差异的。即使同种动物在相同的成熟培养条件下其培养时间也是有所不同的[3]。目前，牛卵母细胞体外培养时间在20～30 h，而猪卵母细胞比较特殊，通常需要48 h左右才能达到核成熟，在24 h的核成熟率几乎为零。Yoshida认为猪卵母细胞体外培养时间不能低于30 h。30 h之前成熟率随培养时间增加而迅速上升，30 h后成熟率随培养时间增加而缓慢上升。猪卵母细胞培养36 h和42 h的成熟率无显著差异，但显著低于46 h的成熟率。Sosnowki等对猪卵母细胞体外成熟的培养时间进行研究，结果显示，培养时间越长成熟率越高，且48 h与36 h之间差异显著[4]。殷骏等研究了体外培养32～56 h对猪卵母细胞体外成熟的影响，发现随着时间的延长，第一极体排出率也逐渐增高，但老化率也相应增长。文国艺等也指出，延长培养时间固然可以提高卵母细胞成熟率，但猪的卵母细胞也会逐渐老化。世界首例转基因克隆猪的成熟培养时间为42～44 h。因此在保证一定的核成熟率的前提下，可以根据自身实验条件缩短猪卵母细胞体外成熟培养时间。

本实验结果表明，体外培养48 h卵母细胞的成熟率最高，但与44 h试验组差异不显著。因此我们可以将44作为后续实验中猪卵母细胞体外成熟的培养时间。

[1] 陈大元.受精生物学-受精机制与生殖工程[M].北京：科学出版社.

[2] 李朝军，范必勤，王金溪.FSH、EGF、胰岛素促进小鼠卵母细胞体外减数分裂恢复机制的研究 [J].细胞生物学杂志，1997，01：27-30.

[3] 闫益波，吕善潮，叶绍辉.猪卵母细胞体外成熟培养的主要影响因素[J].浙江畜牧兽医，2007，32（6）

[4] NamDH，Lee S H，KimH S，et al. The role of gonadotropinreleasinghormone and its receptor in development ofporcinepreim plantation embryos derived from in vitrofertilization [J].Theriogenology，2005，63：190- 201.