王媛媛，胡接力，崔静，黄爱龙，阮雄中,2，陈压西

1 重庆医科大学附属第二医院 教育部感染性疾病分子生物学重点实验室 脂质研究中心，重庆 400016 2 Center for Nephrology, Royal Free and University College Medical School, University College London, Royal Free Campus,London, UK

SM22启动SCAP真核表达质粒的构建及其在CHO细胞中的表达

王媛媛1，胡接力1，崔静1，黄爱龙1，阮雄中1,2，陈压西1

1 重庆医科大学附属第二医院 教育部感染性疾病分子生物学重点实验室 脂质研究中心，重庆 400016 2 Center for Nephrology, Royal Free and University College Medical School, University College London, Royal Free Campus,London, UK

为建立平滑肌特异的固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的裂解激活蛋白(SCAP)超表达的转基因小鼠，深入探讨SCAP的功能，本实验构建了由平滑肌特异蛋白SM22启动子(pSM22)启动仓鼠SCAP 443位点突变体——SCAP(D443N)的真核表达质粒，并在仓鼠卵巢细胞(CHO)验证其表达。利用巢式PCR从小鼠肝脏组织提取的基因组中扩增得到 pSM22基因。先将其插入 pMD-T载体，构建 T-SM22，对 pSM22测序后，通过双酶切将 pSM22克隆到pGL3-control-Luc中，成为pGL3-SM22-Luc。转染pGL3-SM22-Luc到血管平滑肌(VSMCs)中，通过检测荧光素酶(Luc)值观察pSM22在VSMCs内的启动活性。利用PCR从pTK-HSV-SCAP(D443N)质粒中扩增出SCAP(D443N)后克隆入 pGL3-control中，成为 pGL3-SCAP。然后再将 pSM22克隆入 pGL3-SCAP中，成为表达质粒 pGL3-SM22-SCAP(D443N)。转染表达质粒到CHO细胞，用real-time PCR和Western blotting验证SCAP(D443N)的表达。结果证实pSM22在体外VSMCs中能启动Luc的表达; 表达质粒pGL3-SM22-SCAP(D443N)酶切及测序结果正确; 将其转染到CHO细胞后，与转染pGL3-control的对照细胞相比SCAP(D443)mRNA和蛋白表达显著增强。

SM22，启动子，SREBP裂解激活蛋白，质粒构建，基因表达，转染

Abstract:The experiment was designed to investigate the function of SREBP cleavage-activating protein(SCAP)mutant(D443N)by constructing an eukaryotic expressive vector using a smooth muscle specific promoter SM22(pGL3-SM22-SCAP(D443N)).SM22 promoter(pSM22)was amplified from genome DNA of mice by nested PCR, and then cloned into pMD-T vector.The SM22 promoter fragment released from the vector by Kpn I and Hind III digestion was sub-cloned into pGL3-control-Luc vector, to form pGL3-SM22-Luc.The activity of pSM22 in human vascular smooth muscle cells(VSMCs)was tested using Dual-LuciferaseReporter System.SCAP(D443)mutant amplified from plasmid pTK-HSV-SCAP(D443N)and pSM22 from mice liver were cloned into pGL3-control vector to construct pGL3-SM22-SCAP(D443N)which was transfected into Chinese hamster ovary cells(CHO)to test SCAP(D443)expression by real-time PCR and Western blot.The sequence and construction of pGL3-SM22-SCAP(D443N)were correct.SM22 promoter activity initiated the expression of luciferase in VSMCs and also drove SCAP(D443)expression in transfected CHO cells.The pGL3-SM22-SCAP(D443N)eukaryotic expression vector was successfully constructed and the recombinant vector provides a powerful approach in investigating the function and regulation of SCAP and also in producing vascular smooth muscle specific SCAP transgenic mice.

Keywords:SM22, promoter, SREBP cleavage-activating protein, plasmid construction, gene expression, transfection

固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)是存在于内质网的细胞内胆固醇敏感器，也是固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的锚定蛋白，在调节细胞内胆固醇水平中起着非常关键的作用[1]。当细胞内胆固醇缺乏时，它可以将SREBP从内质网运送至高尔基体发生裂解，裂解的活性片段进入细胞核，引起在启动子区域含有胆固醇调节元件(SRE)的下游靶基因转录激活，从而导致细胞对胆固醇的合成和摄取增加。相反，在细胞内胆固醇过负荷时，SCAP与内质网上的固定蛋白胰岛素诱导基因(Insig-1,2)结合，将 SREBP锚定在内质网而不向高尔基体转运，从而停止对下游靶基因(如 LDL受体和HMG CoA还原酶)的转录激活。本研究室大量的前期研究表明，当肝细胞内过度表达SCAP，可以导致肝细胞内脂质摄取与合成增加及脂肪肝发生[2]；当血管平滑肌细胞 SCAP过度表达时，亦会导致胆固醇异常积聚，形成泡沫细胞[3]。虽然野生型SCAP过表达时会引起胆固醇对LDL受体负反馈调节失调，但当 SCAP基因位于胆固醇敏感区的第443个密码子存在点突变时，SCAP将不再受细胞内胆固醇水平的反馈调节，这样会彻底打破细胞内胆固醇对靶基因的负反馈调节[4]。同时，平滑肌特异蛋白 SM22启动子在体外能够广泛表达，而在体内却具有在动脉平滑肌上的表达特异性[5]。因此，本实验选定SCAP(D443N)突变体与SM22启动子(pSM22)，首次构建了 pGL3-SM22-SCAP(D443N)真核表达质粒，为今后建立血管平滑肌特异的SCAP超表达转基因小鼠、深入探讨 SCAP的功能及动脉粥样硬化发生的新机制奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(重庆医科大学教育部感染性疾病分子生物学重点实验室)；血管平滑肌细胞株(VSMCs)(英国Buckinghamshire，TCS cell works)；DMEM-F12培养基、优等胎牛血清(赛默飞世尔化学制品有限公司)；载体 pMD18-T、DNA聚合酶、T4 DNA连接酶及限制性内切酶 BglⅡ、XbaⅠ、BamHⅠ、KpnⅠ、Hind Ⅲ、SalⅠ(大连宝生物工程有限公司)；蛋白提取试剂盒(凯基生物科技发展有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(北京鼎国生物技术有限公司)；转染试剂LipofectamineTM-2000(美国Invitrogen公司)；质粒提取试剂盒，质粒载体pGL3-control、pGL3-enhancer、pEGFP-N1，双荧光素酶报告基因检测系统(美国Promega公司)；质粒pTK-HSV-SCAP-T7(D443N)及兔源抗SCAP多克隆抗体(英国UCL大学皇家自由医学院肾脏病研究中心惠赠)；DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)；兔源抗 β-actin多克隆抗体、羊抗兔 HRP标记二抗(美国santa cluz公司)；引物合成(上海生工生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

CHO细胞株在含10%优等胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的DMEM-F12培养基中，VSMCs细胞在20%优等胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的DMEM-F12培养基中，均于 20% O2、5% CO2、75% N2的常氧孵箱中 37℃培养。

1.2.2 pGL3-SM22-Luc质粒的构建

参考 Moessler等[5]的研究结果，设计两对引物F1、R1和F2、R2(表1)做巢式PCR扩增pSM22。先用外引物F1、R1对小鼠肝脏的基因组DNA进行扩增，再利用内引物F2、R2对上述PCR产物重新扩增获得全长为 2188 bp的 pSM22序列。然后将pSM22的 PCR产物插入 pMD18-T载体，成为T-SM22。由于 pSM22可以正反两种方向插入pMD18-T，对 T-SM22进行酶切鉴定，挑选出酶切位点KpnⅠ位于pSM22上游、Hind Ⅲ位于其下游的质粒进行酶切，然后将切出的 pSM22片段克隆入pGL3-control-Luc中，成为pGL3- SM22-Luc。

表1 PCR扩增引物序列设计Table 1 Primers used in the study

1.2.3 pGL3-SM22-SCAP(D443N)质粒的构建

pGL3-SCAP质粒的构建(图1)：根据GenBank(Accession No.U67060)中的 SCAP序列信息设计一对引物 F3、R3(表 1)，从质粒 pTK-HSV-SCAPT7(D443N)中扩增出SCAP片段，使SCAP上游含有BglⅡ酶切位点和ATG翻译起始密码子，下游含有XbaⅠ酶切位点。用BglⅡ和XbaⅠ酶切pGL3-control质粒和SCAP的PCR产物，将线性带有粘性末端的全长SCAP cDNA和pGL3载体大片段置于 16℃过夜连接，转化入大肠杆菌 DH5α，小量提取获得的质粒pGL3-SCAP。

pGL3-SM22-SCAP(443N)质粒构建(图1)：用BamHⅠ和 SalⅠ酶切 T-SM22，使 pSM22上游含有BamHⅠ的酶切位点，下游含有 SalⅠ的酶切位点，然后将 pSM22克隆入 pEGFP-N1，再用 BamHⅠ和BglⅡ将其酶切克隆到用 BamHⅠ处理的pGL3-SCAP质粒中(BamHⅠ和BglⅡ为同尾酶)。由于pSM22能以正反两种方向与pGL3-SCAP进行连接，利用酶切筛选出pSM22和SCAP方向一致的正确克隆后，获得pGL3-SM22-SCAP(D443N)。

1.2.4 DNA测序

DNA测序由本实验室完成，采用 ABI PRISM 3100 genetic Analyzer全自动测序仪，双脱氧链末端终止法，对T-SM22和pGL3-SM22-SCAP(D443N)中的pSM22及SCAP序列进行测序。同一片段经正反两个方向分别进行测序反应。

1.2.5 pSM22在VSMCs细胞中的启动活性测定

VSMCs转染：按照转染试剂说明于转染前1天接种细胞入24孔板，24 h后至细胞长至90%汇合时，每孔分别定量加入 pGL3-SM22-Luc或 pGL3-control-Luc(阳性对照)或 pGL3-enhancer(阴性对照)0.8 μg和pRL-TK内参照质粒0.1 μg，按照DNA(μg):脂质体(μL)为 1:4 的比例转染 VSMCs，4 h 后换液，继续培养24 h。

报告基因活性检测：转染24 h后按照双荧光素酶(Luc)报告基因检测系统试剂说明裂解细胞，检测Luc活性。分别计算Firefly Luc/Rellina Luc的比值，以pGL3-control-Luc和pGL3-enhance转染细胞作为对照，比较判断pSM22的启动活性。

1.2.6 pGL3-SM22-SCAP(D443N)真核表达质粒的表达

CHO细胞的转染：按照转染试剂说明，转染前一天接种合适密度的细胞至10 cm细胞培养皿，24 h后待细胞长至 90%汇合时，按照 DNA(μg):脂质体(μL)为 1:1.3的比例分别转染 pGL3-SM22-SCAP(D443N)、pGL3-control和pGL3-SCAP至CHO细胞，于4 h后换液，36～48 h后提取细胞总mRNA和胞浆蛋白。

Real-time PCR检测SCAP基因的转录：将CHO细胞的总 RNA逆转录为 cDNA，设计两对引物，仓鼠 β-actin引物 F4、R4和仓鼠 SCAP引物 F5、R5(表1)进行real-time PCR，根据结果进行相对定量分析。

Western blotting检测 SCAP蛋白的表达：收集细胞提取胞浆蛋白后，50 μg/孔上样量进行5%和 8% SDS-PAGE电泳，分离 SCAP和 β-actin，转膜后以5%的脱脂奶粉于TBST中室温封闭1 h，然后用相应的一抗和二抗进行杂交，最后用 ECL显色。

1.3 统计学分析

图1 pGL3-SM22-SCAP(D443N)质粒的构建Fig.1 Construction of plasmid pGL3-SM22-SCAP(D443N).

2 结果

2.1 重组真核表达质粒 pGL3-SM22-SCAP(D443N)的构建与鉴定

由于巢式PCR获得的pSM22 PCR产物可以以正反两种方向插入到pMD18-T中，所以需用酶切的方法挑选出所需方向的克隆，即BamHⅠ和Kpn I位点位于pSM22上游的T-SM22质粒。如果插入方向与预期相符，用Spe I和Hind Ⅲ双酶切克隆质粒即得到约4.4 kb和460 bp的两条片段(图2)。由于BamHⅠ和BglⅡ是同尾酶，当pSM22以这两个酶从pEGFP-SM22中切出，插入由BglⅡ单酶切的pGL3-SCAP质粒时，也会出现正反方向两种插入形式。用酶切的方法挑选出所需方向的克隆，即选出BglⅡ和BamHⅠ的粘末端连接位于pSM22的上游，BglⅡ和BglⅡ粘末端的连接位于下游的克隆为目的质粒，如果插入方向与预期相符，用 BamHⅠ和 BglⅡ双酶切就可得到4.3 kb和5.0 kb两条酶切片段(图3)。

2.2 pSM22及SCAP基因的测序

对质粒 T-SM22和 pGL3-SM22-SCAP中的pSM22及 SCAP序列进行全长测序，结果表明pSM22与文献报道[5]的序列同源性达 99%，SCAP与购买于ATCC的质粒pTK-HSV-SCAP-T7(D443N)中的 SCAP序列一致并存在 SCAP第 1327个碱基G→A的突变，即第443个密码子天冬氨酸(D)→天冬酰胺(N)的突变(图4)。

2.3 pSM22启动子在VSMCs细胞中的活性测定

Luc测定结果显示，SM22在VSMCs中具有启动子活性。pGL3-enhancer阴性对照的测定值为0.23，pGL3-control-Luc的阳性对照值为 0.88(P＜0.05 vs pGL3-enhancer)，pGL3-SM22-Luc的测定值为 1.21(P＜0.05 vs pGL3-enhancer)(图5)。

2.4 Real-time PCR检测细胞内SCAP mRNA的表达

设计内参β-actin引物F4、R4和SCAP引物F5、R5(表1)进行real-time PCR。结果显示，转染SCAP(D443N)的 T组与转染 pGL3-control的C1组和转染pGL3-SCAP的C2组比较，SCAP mRNA表达均有明显的提高。T组与C1组比较SCAP mRNA有22倍的升高(P＜0.05)，两者有显著性差异(图6)。

图2 T-SM22的双酶切鉴定Fig.2 Characterization of T-SM22 by enzyme digestion.1:DNA marker; 2: T-SM22 digested with Hind III and Spe I; 3:T-M22 plasmid.

图3 pGL3-SM22-SCAP的双酶切鉴定Fig.3 Characterization of pGL3-SM22-SCAP by enzyme digestion.1: DNA marker; 2: pGL3-SM22-SCAP plasmid; 3:pGL3-SM22-SCAP digested with BamH I and Bgl II.

图4 SCAP基因测序Fig.4 Sequencing of SCAP.

2.5 pGL3-SM22-SCAP在细胞内的蛋白表达

利用Western blotting技术，以β-actin作为内参，检测分别转染了 pGL3-control、pGL3-SCAP及pGL3-SM22-SCAP(D443N)的CHO细胞的SCAP蛋白表达。正常条件下，CHO细胞中有少量正常SCAP的蛋白表达，但在转染了 pGL3-SM22-SCAP(D443N)后，SCAP蛋白超表达，表达量明显高于对照组(图7)。

图5 双荧光素酶报告基因检测pSM22启动子活性Fig.5 Promoter activity of pSM22 detected by dual-luciferase reporter gene assay.NC: transfected with pGL3-enhancer; T:transfected with pGL3-SM22-Luc; PC: transfected with pGL3-control-Luc.*P＜0.05 compared with NC group.

图6 SCAP mRNA的real-time PCR结果Fig.6 SCAP mRNA level examined by real-time PCR.C1:CHO cells transfected with pGL3-control; C2: CHO cells transfected with pGL3-SCAP; T: CHO cells transfected with pGL3-SM22-SCAP(D443N).*P＜0.05 compared with C1 group.

图7 Westem blotting检测pGL3-SM22-SCAP在CHO细胞中的蛋白表达Fig.7 Expression of SCAP protein in CHO cells(Western blotting).1: CHO cells transfected with pGL3-control; 2: CHO cells transfected with pGL3-SCAP; 3: CHO cells transfected with pGL3-SM22-SCAP(D443N).

3 讨论

正常生理条件下，由于SCAP能敏感地感受到细胞内脂质的变化，从而有效地控制细胞胆固醇的合成和摄取，防止泡沫细胞的形成。然而，在受外界因素如炎症的刺激下，SCAP和SREBP的表达异常增加，以致没有足够的内质网滞留分子，如Insig-1来锁住SCAP，导致即使在高细胞内胆固醇浓度的情况下，仍然运载SREBP到高尔基体内裂解激活，并激活其下游靶基因LDL受体和HMG CoA还原酶的表达，导致细胞(如 VSMCs，肾脏系膜细胞)无控制地摄取和合成LDL胆固醇，形成泡沫细胞[3,6]。当第 443个密码子存在点突变的 SCAP即 SCAP(D443N)存在于细胞内时，细胞将完全打破胞外胆固醇的负反馈调节，SCAP(D443N)不受限制地运载SREBP2至细胞核[4]。因此选择将SCAP(D443N)过表达于细胞内将更有利于泡沫细胞的生成。

平滑肌特异蛋白 SM22是一种在平滑肌中含量丰富的蛋白。将 SM22进行克隆后发现，它可以显著地表达于体外的不同系统，而与这种泛宿主性表达不同的是，SM22在体内同其他平滑肌标志蛋白一样严格特异地表达于平滑肌细胞，而本实验所构建质粒中的pSM22启动子包含了从SM22的转录起始位点至其上游−446 bp的序列，这一区域介导了它在体内动脉平滑肌上的特异性表达[5]。

本实验证实 pSM22在 VSMCs中具有启动子活性。由于VSMCs为原代培养细胞，转染效率有限，且细胞本身 SCAP含量丰富，不利于质粒的表达鉴定。而CHO细胞作为脂代谢相关基因的低背景细胞广泛运用于脂代谢的研究[7-8]，鉴于pSM22在体外细胞的泛宿主性及SCAP(D443N)来源于突变的CHO细胞系，本实验构建了由pSM22启动SCAP(D443N)的真核表达质粒瞬时转染于野生型的CHO细胞，进行表达鉴定。结果发现转染后的CHO细胞内SCAP mRNA及蛋白的表达量都远远高于未转染组，证实构建的真核表达质粒能够正常表达于体外细胞。结合质粒酶切鉴定及测序结果表明质粒构建成功。

由于 SCAP(D443N)的特殊生物学功能，pGL3-SM22-SCAP(D443N)质粒的成功构建对于进一步在体内研究 SCAP的各种调节功能及其在动脉硬化发生的作用具有重要意义；同时也为下一步采用原核微注射技术[9-10]得到动脉平滑肌 SCAP(D443N)特异表达的转基因小鼠提供了材料。

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Construction of pGL3-SM22-SCAP(D443N)eukaryotic expression vector and its expression in CHO cells

Yuanyuan Wang1, Jieli Hu1, Jing Cui1, Ailong Huang1, Xiongzhong Ruan1,2, and Yaxi Chen1
1 Center for Lipid Research, Key Laboratory of Molecular Biology on Infectious Diseases, Ministry of Education, Second Affiliated Hospital,Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China 2 Center for Nephrology, Royal Free and University College Medical School, University College London, Royal Free Campus, London, UK

Received:July 25, 2009;Accepted:September 29, 2009

Supported by:National Natural Science Foundation of China(Nos.30772295, 30871159, 30971389, 30530360), Natural Science Foundation of Chongqing(No.2008BA5016).

Corresponding author:Yaxi Chen and Xiongzhong Ruan.Tel: +86-23-68486780; Fax: +86-23-68486780; E-mail: zlcyxi@sina.com国家自然科学基金(Nos.30772295, 30871159, 30971389, 30530360)，重庆市自然科学基金(No.2008BA5016)资助。