武汉工业学院 刘立鹤

○武汉工业学院农副产品蛋白质饲料

资源教育部工程研究中心 贺国龙

安琪酵母股份有限公司 李兆文

酵母源生物饲料是以酵母为载体，依托现代生物技术，运用微生物发酵和酶解工艺，而获得的具有特定功能和营养性的饲料和饲料添加剂产品。本试验分别采用了凯氏定氮法、Folin-酚法和考马斯亮蓝法对饲用高活性干酵母、酵母细胞壁多糖和复合酵母进行蛋白质含量的测定。

一、材料与方法

1.试验材料与设备。试验酵母源生物饲料样品分别为福邦®饲用高活性干酵母（水产）、福邦®酵母细胞壁多糖（水产）和福邦®复合酵母（水产），为安琪酵母股份有限公司提供。

（1）蛋白质测定所需试剂。凯氏定氮法：硫酸，硫酸铜，无水硫酸钾，40%氢氧化钠，2%硼酸，混合指示剂：甲基红0.1%乙醇溶液，溴钾酚绿0.5%乙醇溶液，两溶液等体积混合，阴凉期保存期3个月以内，0.05mol/L盐酸标准溶液，催化剂为3份硫酸铜与50份无水硫酸钾混合。

Folin-酚法：试剂甲：（A）10gNa2CO3，2gNaOH 和 0.25g酒 石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O）。溶解于500mL蒸馏水中。（B）0.5g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶解于100mL蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。试剂乙(商用成品）标准蛋白质溶液:精确称取0.1018g结晶牛血清清蛋白(BSA)，溶于1L0.9%NaCl溶液中，制成浓度为c=101.8μg/mL的标准蛋白。

考马斯亮蓝法：标准蛋白质溶液（同Folin-酚法所用配制）。考马斯亮蓝G-250染料试剂（南京建成科技有限公司）

（2）试验所需仪器。分析天平0.0001g感量，消煮炉，酸式滴定管（50mL），凯氏烧瓶（500mL），半微量水蒸气蒸馏式，锥形瓶，容量瓶（100mL），通风橱；721型可见光分光光度计；电子计时器；试管、烧杯若干，Agilent1100液相色谱。

2.试验样品前处理。以烘干至恒重的酵母源生物饲料为试验样品，以消除水分对试验结果的影响。

3.蛋白含量的分析方法。

（1）标准蛋白溶液的配制。准确称取标准蛋白m=0.1018g溶于1000mL的蒸馏水中，配制成标准蛋白溶液，浓度为101.8μg/mL。

（2）凯氏定氮法测蛋白质含量。采用GB5511-1985法检测酵母源生物饲料中蛋白质含量，并参考王洁等蛋白质测定的相关注意事项，以减少蛋白质损失。

（3）Folin-酚法测蛋白质含量。标准曲线绘制：取10支大试管，1支作空白，其余试管分成两组，分别加入0、0.05、0.10、0.15、0.20、 0.30、0.40、0.50、0.70、0.90mL标准蛋白质溶液（浓度为101.8μg/mL）。用水补足到1.0mL，然后每支试管加入5mL试剂甲，然后迅速混合，于室温（20～25℃）放置10min。逐管加入0.5mL试剂乙（Folin-酚试剂），立即混匀后，置于室温30min，以未加蛋白质溶液的作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。

（4）考马斯亮蓝法测蛋白质含量。标准曲线绘制：取7支试管，1支作空白，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用101.8μg/mL的标准蛋白质溶液给各试管分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，然后用无离子水补充到1.0mL。最后各试管中分别加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，加完后立即混合，勿过于剧烈。

利用标准曲线，根据未知样品A595值，求出未知样品蛋白质含量。

（5）氨基酸的检测方法。试验样品的氨基酸分析采用6N盐酸水解后，按照国标GB/T18246-2000，用外标法，在Aglient1100上分析，送武汉工业学院分析测试中心进行测定。

4.不同蛋白质检测方法的初步评价。以3种酵母源生物饲料氨基酸检测结果作为标准，与3种不同蛋白质检测方法实际测得的蛋白质值进行比较，初步设定与样品氨基酸结果接近程度作为评价指数，评价指数=100%×被测原料蛋白质含量/被测原料氨基酸含量－100%。

5.统计分析及方法。测定数据用Excel软件中进行初步处理和作图，再用SPSS11.0统计软件对试验数据进行统计分析，结果用平均值±标准误差(X±SD)表示。

二、结果与分析

1.Folin-酚标准曲线的绘制。见图1。

图1 Folin-酚法标准曲线及方程

2.考马斯亮蓝标准曲线的绘制。见图2。

图2 考马斯亮蓝法标准曲线及方程

3.样品检测结果与分析。将干燥好的酵母源生物饲料测定其蛋白质含量。其中，一份用豆浆机物理破碎，加入生理盐水混匀，然后用离心机离心，取上清液稀释适当倍数后，采用不同的蛋白质检测方法测定其蛋白质含量，见表1。

表1 破碎机处理后样品的蛋白质检测值（%） （n=4）

另取一份加入生理盐水，用细胞超声波细胞破碎仪处理后用离心机离心，取上清液，稀释适当倍数后分别用Folin-酚法和考马斯亮蓝法测定其蛋白质含量，见表2。

表2 超声波细胞破碎仪处理后的样品的蛋白质检测值（%） （n=4）

三、讨论

1.凯氏定氮法对测定酵母原料蛋白质含量的影响。由表1可知，凯氏定氮法对饲用高活性干酵母、酵母细胞壁多糖和复合酵母中蛋白质含量测定时结果都与高效液相色谱仪所测氨基酸相差很大，分别偏高50.08%、122.16%和55.64%。这主要是因为凯氏定氮法检测的指标是蛋白质、氨基酸、核酸、尿素和氮为负三价的有机氮化合物，使结果偏高。因此，采用测定总含氮量的方法间接测定酵母源生物饲料中蛋白质含量，检测的蛋白质含量高于实际蛋白质的含量。

2.Folin-酚法对测定酵母原料蛋白质含量的影响。Folin-酚法的优点是灵敏度高，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。

在Folin-酚法中，由于加入了Folin-酚试剂强化了双缩脲反应，使得显色量增强，检测灵敏度提高且比较恒定，因而被广泛应用于不同环境中的蛋白质混合物或粗提物的测定。然而，其操作复杂、费时，且易受到多种因素影响的缺点。

3.考马斯亮蓝法对测定酵母原料蛋白质含量的影响。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此，Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，本试验中饲用高活性干酵母、酵母细胞壁多糖和复合酵母中的精氨酸和苯丙氨酸之和占总氨基酸比例分别为13.45%、18.53%和15.01%，对结果影响较大，但影响多大还不得而知。

四、小结

试验表明，Folin-酚法检测蛋白质浓度为0-91.62μg/mL范围内时与吸光度值有较好的线性关系，相关系数为0.9956。考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度为0-101.80μg/mL范围内时与吸光度值有较好的线性关系，相关系数为0.9916。二者都能较为准确地测定酵母细胞壁多糖的蛋白含量。