徐晓红，孙玉梅，曹 芳，刘鹏飞

（大连工业大学 生物与食品工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引言

微生物采油技术（MEOR）是利用生物技术来提高原油采油率，包括激活内源微生物和注入外源微生物之后利用微生物的有益活动及代谢产物来提高原油采收率。MEOR是继热力驱、化学驱、聚合物驱等传统三次采油方法之后的第4种提高原油采收率的技术［1］，与其他三次采油技术相比，具有适用范围广、工艺简单、投资少、见效快、功能多、不损伤油层和无污染等优点，具有良好的发展前景［2］。选择优势菌株是MEOR的关键。尽管国内已经采用自主研制的采油菌剂，但是进口菌剂在国内市场仍然占很大比例。因此筛选出优势菌株不仅可以减少对进口菌剂的依赖，也将对MEOR有更深入的了解［3］。作者分别从采油菌剂和原油中分离出微生物菌株，并对分离菌株的发酵特性和生理生化特性进行研究。

1 实 验

1.1 菌 源

采油菌剂和原油，辽河油田丰华应用技术综合厂提供。

1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，水1L，pH 7.0。

发酵培养基：液体石蜡20mL，KH2PO42g，Na2HPO41.5g，（NH4）2SO42g，MgSO40.2g，水1L，pH7.0。

1.3 采油菌株的分离

1.3.1 菌悬液的制备

将2g采油菌剂加入到10mL无菌水中，振荡混匀。

取2g原油加入到50mL无菌水中，加入0.3%吐温80，并加入玻璃珠，摇床振荡培养7d。

1.3.2 富集培养

将菌悬液以2%的接种量接入到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃静置培养48h。

1.3.3 分离纯化

将富集培养液用无菌水稀释至合适浓度，取0.1mL菌液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，30℃静置培养48h。根据菌落形态差异挑取单菌落继续划线，经多次划线分离纯化获得纯菌落。

1.4 分离菌株发酵特性的研究

1.4.1 种子液的制备

将分离菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃静置培养48h。

1.4.2 发酵培养及发酵上清液的制备

以5%的接种量将种子液接入发酵培养基中，于30℃静置培养7d。将发酵液用中速定性滤纸过滤除去液体石蜡，滤液于3 000g离心20min除菌，上清液待测。

1.4.3 表面张力及pH测定

采用表面张力测定上清液表面张力，采用pH3-3C精密pH计测定上清液pH。

1.4.4 产气测定

在倒置放入杜氏小管的发酵培养基中接入5%种子液，密封试管口，于30℃静置培养7d，观察杜氏小管中是否有气泡产生。

1.4.5 原油乳化效果

将100mL发酵7d的发酵液倒入装有2g原油的250mL三角瓶中，密封瓶口，于30℃静置7d，观察发酵液乳化原油的情况。

2 结果与讨论

2.1 采油菌株的分离

根据菌落形态的不同从采油菌剂和原油中共分离出11株菌，其菌落形态见表1、2。从实验结果可以看出，从原油分离所得Y-2、Y-4和Y-6的菌落形态与从采油菌剂分离所得菌株相似。本研究分离出的11株菌的菌落形态与国内一些研究者筛选的采油微生物有相似之处［4］。

表1 从采油菌剂分离菌的菌落形态Tab.1 Colony morphology of the strains isolated from bacteria agent

表2 从原油分离菌的菌落形态Tab.2 Colony morphology of the strains isolated from crude oil

2.2 分离菌株的发酵特性

对分离微生物的发酵液相关特性及其对原油乳化效果进行分析，结果见表3。由表3可见，在本研究的发酵条件下，分离菌株不能产生气体，其发酵上清液的pH值没有降低，而表面张力有不同程度的降低，各菌株发酵液对原油均有不同程度的乳化作用，但不是表面张力降低率越低，发酵液对原油的乳化效果越好。说明分离微生物可以产生表面活性物质，但菌株产生的表面活性物质不是乳化原油的唯一因素。目前报道的能够产酸和产气的采油微生物较少，而产生物表面活性物质的微生物较多［5-7］。

表3 分离菌株的发酵特性Tab.3 Fermentation characteristics of the isolated strains

2.3 分离菌株的生理生化特性

从采油菌剂分离的菌株与Y-4菌体形态相似，呈杆状，有球杆之间变化，菌体大小为（0.9～1.6）μm×（1.5～2.5）μm。Y-2和Y-6呈杆状，有球杆之间变化，菌体大小为（0.8～1.2）μm×（1.8～3.0）μm。Y-1和Y-5呈杆状，有椭圆形芽孢位于菌体中央，菌体大小为（0.5～0.25）μm×（1.2～5.0）μm。Y-3呈棒杆状，有栅状排列，菌体大小为（0.3～0.8）μm×（1.5～8.0）μm。主要生理生化特性见表4、5。

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，分析实验结果可知，Y-1和Y-5属于芽孢杆菌属（Bacillus），Y-2和Y-6属于节杆菌属（Arthrobacter），Y-3属于棒杆菌属（Corynebacterium），Y-4、J-1、J-2、J-4、J-5和J-6属于不动杆菌属（Acinetobacter）。大多数分离菌株为兼性厌氧菌，具有运动性，不产生硫化氢，能够利用一些廉价碳源产生有机酸和气体，这些特性有利于菌株应用于微生物采油。

表4 分离菌株的生理生化特性Tab.4 Physiological and biochemical characteristics of the isolated strains

表5 分离菌株的碳源发酵试验Tab.5 Carbohydrate fermentation test of the isolated strains

3 结论

本研究从采油菌剂及原油中共分离出11株细菌，经发酵特性研究表明，分离菌株不产气，但可以产生物表面活性物质，其发酵液对原油有不同程度的乳化作用。通过形态学观察和常规的生理生化实验，对分离菌株进行初步鉴定，Y-1和Y-5为芽孢杆菌属（Bacillus），Y-2和Y-6为节杆菌属（Arthrobacter），Y-3为棒杆菌属（Corynebacterium），Y-4、J-1、J-2、J-4、J-5和J-6为不动杆菌属（Acinetobacter）。分离菌株的发酵特性和生理生化特性表明这些菌株有望在微生物采油中得到应用。