王德彬,彭 焱,覃 瑞,陈 玉

（1.中南民族大学药学院,武汉430074;2.武汉生物制品研究所血液制剂室,武汉 430060;3.中南民族大学生命科学学院,武汉430074;4.中南民族大学化学与材料科学学院,武汉替换为 430074）

链球菌制剂预防性治疗实验动物糖尿病机理研究

王德彬1,彭 焱2,覃 瑞3,陈 玉4＊

（1.中南民族大学药学院,武汉430074;2.武汉生物制品研究所血液制剂室,武汉 430060;3.中南民族大学生命科学学院,武汉430074;4.中南民族大学化学与材料科学学院,武汉替换为 430074）

为了探讨链球菌制剂预防性治疗糖尿病的机理,以纯系的自发性糖尿病NOD小鼠和链脲霉素诱导糖尿病鼠为动物模型,从5周～20周皮下注射链球菌制剂0.1 mg/只,对照组注射等量生理盐水,观察其发病率.至40周时链球菌制剂组均未发病,而生理盐水组发病率为70%.取胰腺组织作病理切片,Fas、FasL染色及胰岛β细胞染色.未发病鼠无Fas表达,但有FasL的表达;已发病鼠有Fas的表达;经链球菌制剂免疫后小鼠有 FasL表达.相同的结果也出现在以链脲霉素（STZ）诱导的迟发型糖尿病模型鼠中.链球菌制剂可能通过改变Fas L/Fas系统在胰腺组织的表达,来预防性治疗糖尿病,发挥免疫调节作用.

A群溶血性链球菌制剂;糖尿病;NOD小鼠;链脲霉素

糖尿病是一种急性或慢性的代谢障碍性疾病,主要是由于胰岛素的绝对或相对缺乏所引起.已有大量事实证明,无论是1型糖尿病还是2型糖尿病,其发病均与胰腺内分泌细胞功能异常有关,尤其是与β细胞的功能不足有很大关系.糖尿病已成为人类第5位死亡主因,并且还可能引发多种并发症[1].因此,众多的中外学者对其发病机理和治疗方法进行了积极的研究.糖尿病的发病机制十分复杂,随着免疫学研究的逐步深入,证实凋亡在免疫系统的平衡中是一个关键因素,凋亡机制的破坏可能是自身免疫失调的原因.链球菌制剂作为生物反应调节剂,已广泛应用于临床抗肿瘤治疗,使用安全,来源丰富.它与国外的A群溶血性链球菌OK-432[2]属同类制剂,能直接杀伤肿瘤细胞及改善机体免疫功能,本实验以糖尿病动物为模型,研究链球菌制剂在体内预防性治疗糖尿病的机制,为开发链球菌制剂新的适应症提供实验基础和理论依据.

1 实验方法

1.1 实验动物的分组

选用30只5周龄雌性NOD小鼠（购自上海斯莱克实验动物中心）.随机分为两组,一组20只,为实验组,皮下注射链球菌制剂 0.1 mg/只/周,共15周;另一组10只,为对照组,每周皮下注射等量生理盐水.所有小鼠喂食普通饲料并自由饮水.另取20只8周龄雌性NOD小鼠（购自上海斯莱克实验动物中心）,以300 mg/kg CP（环磷酰胺）一次性腹腔注射,随机分为两组,每组10只,一组皮下注射链球菌制剂0.1 mg/只,连续注射7 d,另一组皮下注射等量生理盐水7 d.

1.2 采血方法、血样处理及血糖测定

采用上海生物制品研究所提供的葡萄糖氧化酶法试剂盒测血糖.小鼠10周龄以后每周监测血糖,统计小鼠发病率.

1.3 自发性糖尿病 NOD鼠胰岛β细胞 FAS及

FAS-L免疫组化染色

NOD小鼠开腹,分离胰腺,取胰尾入10%甲醛固定6 h,常规梯度酒精脱水,透明,浸蜡,包埋,常规切片脱蜡至水.Insulin Ab-6（INS04+INS05）:晶美公司,对胰岛细胞进行免疫组化染色;采用武汉博士德生物工程有限公司提供的免疫组化染色试剂盒对胰岛β细胞进行 FAS、FAS-L免疫组化染色.

1.4 链球菌制剂对链脲霉素诱导小鼠迟发型糖尿病的治疗作用

正常昆明种小鼠（武汉生物制品研究所实验动物中心提供,20～22 g）以10 mg/kg剂量腹腔注射链脲霉素,每周1次,连续5周诱导 PBS鼠,血糖检测结果表明小鼠血糖在第2周开始升高,在注射5周后发生迟发型糖尿病.实验组1为模型鼠,成模后立即以链球菌制剂连续治疗7 d;实验组2为模型鼠,成模7 d后以链球菌制剂连续治疗7 d;实验组3为模型鼠,成模14 d后以链球菌制剂连续治疗7 d;实验组4为模型鼠,成模21 d后以链球菌制剂连续治疗7 d,观察链球菌制剂的治疗效果.

1.5 链脲霉素诱导糖尿病模型鼠胰岛β细胞FAS及FAS-L免疫组化染色

方法同1.3.

2 实验结果

2.1 NOD小鼠糖尿病的发病率

本实验中用链球菌制剂处理的20只雌性NOD鼠直到实验结束（40周）没有发病鼠（见表1）,对照组（10只）于第14周开始出现糖尿病鼠,至实验结束时发病率达到了70%（7/10）.而注射环磷酰胺的20只NOD鼠,10只经链球菌制剂免疫的均未发病,对照组10只发病率达到了80%（8/10）.说明链球菌制剂完全可以预防NOD鼠糖尿病的自然发生和环磷酰胺促发的糖尿病的发生.

表1 链球菌制剂对NOD小鼠发病率的影响Tab.1 Effects of kanserin on incidence of diabetes in female NOD mice

2.2 自发性糖尿病 NOD鼠胰腺组织胰岛β细胞染色及免疫组化染色

取未发病鼠、已发病鼠及经链球菌制剂免疫后小鼠的胰腺组织作病理切片,每张病理切片均作Fas和Fas-L的单个染色.

图1 未发病NOD鼠的胰岛β细胞Fig.1 The pancreatic isletβcell of non-diabetic NOD mouse（400×）

图2 已发病NOD鼠的胰岛β细胞Fig.2 The pancreatic isletβcell of diabetic NOD mouse（400×）

图3 链球菌制剂处理过的NOD鼠胰岛β细胞Fig.3 The pancreatic isletβcell of hemolytic streptococci-treated NOD mouse（400×）

2.2.1 胰岛β细胞染色 链球菌制剂对受损的胰岛β细胞具修复作用,对保持胰岛β细胞的细胞结构完整、维持正常的生理功能有着重要的作用,在一定意义上阻止了糖尿病的发生.

2.2.2 胰岛β细胞Fas及FasL染色 未发病鼠:胰岛β细胞无Fas表达,但表达FasL.

已发病鼠:胰岛β细胞有 Fas的表达,周围有表达FasL的细胞浸润.

链球菌制剂免疫后小鼠:胰岛β细胞有 FasL的表达,不表达 Fas.

提示Fas的异常表达与糖尿病的发生有关,Fas-FasL途径是糖尿病发病过程中β细胞凋亡的方式之一,也说明了链球菌制剂对胰岛β细胞的保护作用.

2.3 链球菌制剂对链脲霉素诱导迟发型糖尿病鼠

的治疗作用

多次注射小剂量STZ后诱导胰岛β细胞发生轻度改变,自身被激活的 T淋巴细胞将胰岛β细胞当作靶细胞进行攻击,从而导致自身免疫过程的发生,诱导迟发型糖尿病,该过程类似于人的1型糖尿病.应用链球菌制剂对成模小鼠进行治疗,发现间隔7 d、14 d注射的两组各有1只血糖恢复正常,而成模后马上注射及间隔21 d注射的,没有治疗效果.

图4 未发病NOD鼠胰岛细胞表达Fas-LFig.4 Expressed Fas-L on islet of non-diabetic NOD mouse（400×）

图5 已发病NOD鼠胰岛细胞表达FasFig.5 Expressed Fas on islet of diabetic NOD mouse（400×）

2.4 取链脲霉素诱导迟发型糖尿病鼠胰岛β细胞免疫组化染色

取正常组、模型组、链球菌制剂治疗组小鼠胰腺组织Fas及FasL免疫组化染色.

正常组:胰岛β细胞无 Fas表达,但表达FasL.

模型组:胰岛β细胞有 Fas的表达,周围有表达FasL的细胞浸润.

链球菌制剂治疗组:胰岛β细胞有FasL的表达,不表达 Fas.

说明链球菌制剂对STZ诱导的迟发型糖尿病鼠胰岛β细胞损伤有一定的修复作用.研究结果提示,Fas-FasL途径可能也是STZ诱发的迟发型糖尿病鼠胰岛β细胞凋亡的方式之一.

图6 链球菌制剂处理的NOD鼠胰岛细胞表达Fas-LFig.6 Expressed Fas-L on islet of hemolytic streptococci-treated NOD mouse（400×）

图7 未发病鼠胰岛细胞表达Fas-LFig.7 Expressed Fas-L on islet of non-diabetic mouse（400×）

图8 以链脲霉素诱导的迟发型糖尿病鼠胰岛细胞表达FasFig.8 Expressed Fas on islet of delayed diabetic mice with STZ（400×）

图9 经链球菌制剂治疗的迟发型糖尿病鼠胰岛细胞表达Fas-LFig.9 Expressed Fas-L on islet of delayed diabetic mice with STZ by hemolytic streptococci-treated（400×）

3 讨 论

3.1 链球菌制剂对 NOD小鼠糖尿病的发病率的影响

NOD鼠是1型糖尿病的动物模型[3],杨竹林[4]等从10周龄开始观察NOD鼠是否有糖尿病（DM）症状出现,当出现多饮、多尿、消瘦等症状时,断尾取血测定血糖值,若连续2次>11.1 mmol/L,则确定为糖尿病.环磷酰胺（CP）可选择性地去除某些抑制性 T细胞的功能而加速NOD鼠发病.本实验表明链球菌制剂可以阻止糖尿病的发生,且早期注射链球菌制剂的未发病NOD鼠血清胰岛素水平远高于发病鼠,而胰岛素由胰腺β细胞分泌,提示链球菌制剂对早期受损的胰岛β细胞具有保护和修复作用.

3.2 NOD鼠胰腺组织胰岛β细胞染色及免疫组化染色

随着细胞组织免疫化学染色技术的飞速发展,在糖尿病机制的研究中有关β细胞形态学的探讨越来越受到人们的重视[5].本实验中胰岛β细胞染色结果显示,发病组切片与正常组切片比较,两者在形态学上有很大差异,发病组胰岛数目少,β细胞松散排列,分布不规则.链球菌制剂免疫组胰岛β细胞的形态与未发病组无大的差别,说明链球菌制剂对NOD鼠β细胞的形态有明显的改善作用.

作为在中枢和周围淋巴器官选择淋巴细胞库的方式,凋亡机制的破坏可能是自身免疫失调的发病原因.Fas（CD95）属于肿瘤坏死因子受体家族,FasL和Fas结合后,通过活化下游的凋亡通路可诱导表达Fas细胞的凋亡.本实验采用 Fas/FasL免疫组化方法对胰腺组织进行染色发现,未发病鼠胰岛β细胞在正常情况下表达 FasL,但不表达Fas;发病鼠许多细胞因子和炎症介质可促进胰岛β细胞大量表达Fas,其附近有表达FasL的细胞浸润,说明1型糖尿病β细胞凋亡与 Fas/FasL通路的活化密切相关,1型糖尿病β细胞凋亡主要是Fas的异常表达所致,而胰岛内细胞因子的异常也增强了Fas和FasL之间的相互作用.

3.3 链球菌制剂对链脲霉素诱导迟发型糖尿病鼠的治疗作用

自Rakieten[6]等文献6中为1963年首次报告链脲霉素（streptozotocin STZ）有致糖尿病的作用以来,国内外有学者利用不同剂量的STZ来复制糖尿病模型.STZ为一种广谱抗菌素,具有抗菌、抗肿瘤的性能,但它同时具有致糖尿病的副作用[7],对实验动物胰岛β细胞具有高度选择性的毒性作用,是目前使用最广泛的糖尿病动物模型化学诱导剂.Junod等[8]通过光镜观察表明,STZ能直接破坏胰岛的β细胞,导致胰岛功能受损,血糖升高.STZ诱导小鼠糖尿病高血糖状态持续3周以上确定为DM小鼠模型[9].注射小剂量STZ,诱导胰岛细胞发生轻度改变,炎性细胞浸润并释放细胞因子,放大细胞损伤效应,最终导致迟发型糖尿病[10-11].本实验以链球菌制剂治疗迟发型糖尿病鼠,刚成模的小鼠因为其胰岛浸润细胞主要为炎性细胞,注射链球菌制剂后,激活机体的淋巴细胞,增强细胞免疫功能,进一步扩大炎症反应,因而仍然保持高血糖水平.间隔一段时间后,链球菌制剂通过上调 TH2型细胞因子,从而下调 TH1型细胞因子,对轻度受损的胰岛β细胞进行修复,从而起到降低血糖的作用.通过免疫组化染色观察模型鼠与正常鼠及链球菌制剂治疗鼠的胰岛改变及Fas的表达,证明链球菌制剂对STZ造成的糖尿病鼠胰岛β细胞损伤有一定的修复作用,对保持胰岛β细胞的细胞结构完整、维持正常的生理功能有着重要的作用,在一定意义上防止了糖尿病的发生.提示促进受损胰岛β细胞的修复,保护胰岛β细胞是链球菌制剂治疗糖尿病的机理之一.

需要指出的是,NOD鼠与迟发型糖尿病鼠虽然都是1型糖尿病动物模型,但NOD鼠从患胰岛炎到发生糖尿病,时间间隔几个月,当糖尿病确诊时,胰岛受损已很严重,且体重大为减轻,此时用链球菌制剂治疗,可能太晚,这也是链球菌制剂对速发型糖尿病鼠没有治疗效果的原因.

4 结论

链球菌制剂能阻止NOD鼠糖尿病的自然发生及环磷酰胺促发的NOD鼠糖尿病的发生,Fas-FasL途径是糖尿病发病过程中β细胞凋亡的方式之一.链球菌制剂对正常胰岛β细胞具有保护作用,促进轻度受损胰岛β细胞的修复可能是链球菌制剂治疗糖尿病的机理之一.链球菌制剂对糖尿病的预防性治疗作用可作为该药新的适应症可能应用于临床.

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Abstract:To study the effectiveness of Group A hemolytic streptococci on diabetes mellitus in mice model and its possible mechanism.female NOD mice of Group A hemolytic streptococci-treated group were injected with 0.1 mg Group A hemolytic streptococci weekly from 5 weeks to 20 weeks and control group with 0.1ml NS（normal saline）to investigate the incidence.The mice were sacrificed at 40 wk or when diabetes occurred.The pancreatic tissues were routinely processed and underwent Fas and FasL staining with ABC immunohistochemical method,isletβcell stained through insulin Antibody.The incidence of diabetes in the Group A hemolytic streptococci group was zero which obviously less than 70%in the control group..Fas only expressed on islets of the mice suffering from diabetes,whereas Fas ligand expressed on islets of the mice injected with Group A hemolytic streptococci and NS.Similar results in rapid and delayed diabetic experimented models in Kun-ming mice with streptozotoein（STZ）.Group A hemolytic streptococci possessed the therapeutic and preventive effects on diabetic mice,The immune mechanism of Group A hemolytic streptococci treatment is closely related to the expression of Fas ligand/Fas system on the pancreatic tissues.Group A hemolytic streptococci appears to have a immune-regulatory effect on diabetes mice.

Key words:group A hemolytic streptococci;diabete;NOD mice;streptozotoein

Therapeutic and protective mechanism of Group A hemolytic streptococci on diabetes

WANG Debin1,PENG Yan2,Qin Rui3,CHEN Yu4
（1.College of Pharmacy,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074;2.Bolld Preparatious Lab,Wuhan Institute of Biologic Products,Wuhan 430060;3.College of Life Science,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074;4.College of Chemistry and Materials,South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074）

R965.1

A

1000-1190（2010）04-0648-05

2010-05-30.

湖北省自然科学基金项目（2006ABA367）.

＊通讯联系人.E-mail:chenyuwh888@126.com.