刘国安,闵建平,张佳佳,颉耀强,丁 兰,杨 红

（西北师范大学生命科学学院,兰州替换为 730070）

香茶菜属植物中的三萜化合物对脂质过氧化和DNA损伤的保护作用

刘国安＊,闵建平,张佳佳,颉耀强,丁 兰,杨 红

（西北师范大学生命科学学院,兰州替换为 730070）

通过检测对 H2O2处理的人外周血单个核细胞的DNA损伤、鼠肝微粒体脂质过氧化和pBR322 DNA氧化断裂的保护作用,测定了从香茶菜中提取到的4种三萜化合物的抗氧化活性.结果表明,4种化合物在这3种体系中发挥着不同的作用.熊果酸在所有体系中保护作用最强;2α,3β-二羟基-乌苏-12-烯-28-酸在抑制脂质过氧化时活性强,而在抑制单链DNA断裂中作用较弱;其异构体2α,3α-二羟基-乌苏-12-烯-28-酸作用正好相反;齐墩果酸仅在在 H2O2处理的单个核细胞层DNA损伤中具有微弱保护作用.

三萜化合物;香茶菜;抗氧化活性;彗星电泳;脂质过氧化;DNA链断裂

唇形科植物香茶菜（labiatae isodon）在世界范围,尤其在中国、日本和韩国种植广泛.其中许多种类在中国是很重要的中草药材,被用来作为抗炎、抗肿瘤、清热解毒和治疗无明肿痛的药物[1],但目前对这些植物药理学的研究还非常有限.

抗癌和抗炎症的机制与抗氧化作用密切相关[2-3].因此,具有抗氧化性的化合物有望成为抗肿瘤和抗炎症的候选药物.单细胞凝胶电泳也称彗星电泳技术,近些年被广泛应用并得到不断发展.被广泛用于检测具有潜在抗氧化作用的物质[4].微粒体,尤其是来自光面内质网的部分,因含有大量的多不饱和脂肪酸而易受氧化胁迫的影响,已被广泛作为氧胁迫和抗氧化研究的一种模型.三萜化合物是香茶菜属植物（Isodon）中的主要次生代谢物,本文中的4种三萜化合物是从总序香茶菜（Isodon racemosa（Hemsl）Hara）和兰萼香茶菜（Isodon japonica（Burm.f）.Hara var.galaucocaly x（maxin）Hara.）中分离提纯,经 IR,UV,MS和NMR等多种波普技术并结合标样对照鉴定了它们的结构[5-6].本文检测了它们对经 H2O2处理的人外周血单个核细胞中DNA损伤的保护作用、抑制小鼠肝微粒体中由Fe2+/VC启动的脂质过氧化作用,以及对AAPH诱导的质粒DNA氧化断裂的保护作用.

1 材料与方法

1.1 受试化合物与试剂

4种分离自香茶菜的三萜化合物为熊果酸（Ursolic acid,UA）、2α,3β-二羟基-乌苏-12-烯-28-酸 （2α,3β,dihydroxy-urs-12-en-28-oid acid,HU1）、2α,3α-二羟基-乌苏-12-烯-28-酸 （2α,3α,dihydroxy-urs-12-en-28-oid acid,HU2）和齐墩果酸（Oleanolic acid,OA）.结构见图1.

AAPH（2,2-偶氮二（2-脒基丙烷）二盐酸盐）、琼脂糖、溴化乙锭、抗坏血酸和芦丁均购自 Sigma,质粒pBR322购自 SABC,其他试剂均为国产分析纯.

1.2 对由 H2O2处理的单个核细胞DNA氧化损伤的保护作用

将新鲜分离的健康人外周单个核细胞分别与不同浓度的 4种三萜化合物进行孵育,以50μmol/L H2O2于4℃处理 10 min,通过单细胞凝胶电泳检测单个核细胞中的DNA损伤[7].细胞DNA损伤时因其DNA断裂,电泳时从核中迁出,呈彗星状,无损伤的细胞DNA呈圆形.统计彗星状细胞所占的百分率,可反映DNA损伤的程度.

图1 从香茶菜属（L abiatae Isodon）植物中分离提取的4种三萜化合物的结构Fig.1 Structure of seven triterpenoids from Labiatae Isodon

1.3 脂质过氧化的测定

微粒体的制备参照文献[8].Wistar小鼠饥饿过夜后,断颈处死并立即取出肝脏,匀浆经两次离心后得微粒体.Lowry法测定蛋白质浓度.

将小鼠微粒体和不同浓度三萜化合物加入Fe2+/VC启动的脂质过氧化反应体系.37℃振荡孵育1 h后,三氯醋酸终止反应,加入硫代巴比妥酸显色测定脂质过氧化产物丙二醛,上清液于532 nm比色.计算不同化合物的半抑制浓度（IC50）.

1.4 测定单链DNA氧化断裂

质粒pBR322DNA主要以超螺旋型存在,当受到氧化损伤断链时,DNA会先打开一条核酸链而解为环状,当损伤进一步加强时,第二条核酸链也会被打开而呈线型.实验时将100 ng的pBR322质粒DNA和化合物与10μmol/L自由基引发剂AAPH混匀,37℃孵育1 h.然后将样品进行琼脂糖凝胶电泳后,用 EB染色,于凝胶成像分析系统中观察照相.

1.5 统计数据

实验重复3次,数据以均值±SD表达.

2 结果与分析

2.1 对单个核细胞中H2O2处理的DNA氧化损伤的保护作用

如图2所示,细胞经 H2O2处理后,DNA损伤的细胞呈彗星状.未处理细胞只有9.6%呈彗星状,此为单个核细胞的基础 DNA损伤.当用50μmol/L H2O2处理细胞10 min后,有96.9%的细胞呈彗星状.槲皮素（quercetin,Q）是实验室经常使用的抗氧化剂.实验中作参照.

图2 单细胞凝胶电泳图细胞DNA损伤（有尾）和无损伤（圆形）（×400）Fig.2 Cells image after single cell micro gel electrophoresis.Cells with（a long tail）and without（circular）damaged DNA

图3 三萜化合物对 H2O2诱导的人外周血单个核细胞损伤的保护作用Fig.3 Protection of triterpenoids from H2O2-induced DNA damage in human peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）

4种化合物的作用从图3可看出,它们对H2O2处理的DNA氧化损伤具有不同的保护能力,但作用都不强,均弱于槲皮素.OA与UA的作用相近,HU1和 HU2的作用相近.

2.2 对脂质过氧化的抑制作用

4种三萜化合物对小鼠肝微粒体的脂质过氧化均具有抑制作用,且存在浓度依赖性.如表1中显示.其中UA的抑制作用最强,程度与槲皮素相当;HU1的抗氧化活性明显强于 HU2,且差异较大（IC50HU1=33.1μmol/L,IC50HU2=103.9μmol/L）;而OA的活性很弱.UA与OA的结构相似,仅因CH3位置不同,UA的抑制作用就远高于OA,比后者高20倍.4种三萜化合物对脂质过氧化的抑制作用的顺序如下:UA>HU1>OA>HU2.

表1 三萜化合物对脂质过氧化的半抑制浓度Table 1.Half inhibition concentration（IC50）of triterpenoids on lipid peroxidation

2.3 对链状DNA氧化断裂的保护作用

为了进一步阐明三萜化合物的抗氧化作用,采用质粒pBR322 DNA,由 AAPH诱导断裂,检测化合物对无细胞体系DNA的保护作用.见图4.

图4 三萜化合物对AAPH引起的pBR322DNA断裂的保护作用Fig.4 Effects of triterpenoids on pBR322 DNA strand break induced by 10mmol/L AAPH

从图4（1）中可以清楚地看出,4种化合物对DNA氧化损伤都有一定的保护作用,并具浓度依赖性.UA作用较强,从25μmol/L起就表现出保护能力（1,D）,100μmol/L时可完全保护DNA损伤（1,F）,表现为超螺旋型pBR322质粒DNA的条带和未处理样（1,A）相同.而OA的作用很弱,在2 000μmol/L时仍只有微弱的保护效果（1,I）.在图4（2）中,二种二羟基熊果酸也显示较强的作用,且 HU2的作用强于 HU1.HU1在200μmol mol/L（2,D）时有明显的作用,1 600μmol/L时完全保护（2,G）;而 HU2在400μmol/L时就有了完全的保护作用（2,J）,但 HU1与 HU2保护能力比UA弱.因此,对DNA氧化损伤的保护能力,由强到弱为UA>HU2>HU1>OA.

3 讨论

人体的氧化胁迫状态与炎症、癌症、自身免疫疾病、糖尿病、各种心脑血管疾病、老年性痴呆等有关.炎症过程涉及激活吞噬细胞合成和释放大量的活性氧,从而导致组织和细胞损伤[9].提高具有抗氧化能力物质的摄入可能预防和降低炎症的发生.因此,很多实验都在探讨抗氧化剂作为治疗相关疾病药物的可能性[10].癌变过程是多步骤的复杂过程,但与氧化胁迫和炎症造成的损伤密切相关[11].因此具有抗氧化和抗炎作用的化合物就有可能作为抗肿瘤药物.

植物中广泛存在三萜化合物.常见三萜化合物UA和OA最重要的生物活性是保肝[12],近些年有些研究报告了三萜类化合物的各种生物活性[13-14],但有关来自香茶菜的三萜化合物抗氧化作用方面的研究未见报道.彗星电泳可用来检测检H2O2诱导的细胞DNA损伤及化合物的保护作用[7].在脂质过氧化体系中,自由基攻击多不饱和脂肪酸,形成各种细胞毒醛类物质.多种病理、生理过程涉及到脂质过氧化.AAPH在37℃能产生自由基造成DNA链断裂等生物大分子损伤.

通过对4种三萜化合物在以上3个体系中抗氧化作用的检测可以看出:UA在3个体系中均具有最强的保护作用;而其异构体OA仅能减轻单核细胞中 H2O2诱导的DNA氧化损伤,在脂质过氧化和pBR322质粒DNA氧化损伤中保护作用都非常弱;比 UA多了一个羟基的 HU1和 HU2在3个体系中作用差异较大,对细胞的DNA氧化损伤二者只有微弱作用,在脂质过氧化中,HU1的作用远比 HU2强,约高2倍,而在对无细胞DNA氧化体系中,作用正好相反.

UA是在这三种测试体系中最有效的抗氧化剂.特别是在抑制脂质过氧化中,比其它化合物强5倍多.UA包含一个羟自由基而 HU有两个,这意味着三萜化合物中仅是羟基的数目不能决定在这些条件下的抗氧化强度.这与其他抗氧化剂不同,如黄酮类化合物.但是,羟自由基确实是官能团.如果-OH被乙酰基 （AcO型）替换,抗氧化作用明显减弱（数据未显示）.HU1和 HU2有相同的结构骨架,只是第三位-OH的构型不同（见图1）.在脂质过氧化体系中,HU1显示很强的抑制活性（IC50=33.1）,HU2却很弱 （IC50=103.9）;而在DNA氧化损伤的保护中正好相反,这意味着OH-的位置是很重要的,其变化的构型在不同的体系中发挥着不同的作用.UA和 OA唯一不同的是29-CH3.UA中位于19-C,而在 OA中位于20-C.在脂质过氧化和DNA链断裂体系UA是最有效的化合物,然而OA是最弱的.所以-CH3,这个从未报道过有抗氧化作用的集团,其三维位置对其活性也有非常重要的影响.

本文结果显示,三萜化合物的抗氧化作用机制复杂,羟基及-CH3的位置和数目都可能会影响其对DNA损伤的保护和抑制脂质过氧化的作用,因此三萜化合物的抗氧化机制仍需更深入的研究.

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Abstract:The antioxidative effects of seven triterpenoids separated from labiatae Isodon were examined by testing their protection against DNA damage in human peripheral blood mononuclear cells induced by H2O2,inhibition of lipid peroxidation and DNA strand breakage.These triterpenoids exerted variably protective effects in these systems.Ursolic acid has the strongest protective effects in all three systems.2α,3β,dihydroxy-urs-12-en-28-oid acid are effective in inhibiting lipid peroxidatian but weak in protection DNA strand breakage.It's isomer 2α,3α,23-trihydroxy-urs-12-en-28-oic-acid showed opposite actions.Oleanolic acid is only effective in DNA damage induced by H2O2in single cell.The relationship between antioxidations and structures are also discussed.

Key words:Triterpenoid;labiatae isodon;antioxdation;comet assay;lipid peroxidation;DNA strand breakage

Inhibitions of lipid peroxidation and protection of DNA damage by triterpenoids fromlabiatae Isodon

LIU Guoan,MIN Jianping,ZHANGJiajia,XIE Yaoqiang,DING Lan,YAN G Hong
（College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou,730070）

Q946

A

1000-1190（2010）04-0629-04

2010-06-30.

国家自然科学基金项目（30960464）;甘肃省教育厅研究生导师项目（0901-05）;西北师范大学知识与科技创新工程项目（NWNU-KJCXGC-03-65）.

＊E-mail:liuguoan@nwnu.edu.cn.