魏 凤,管 宇,王金良,祖立闯,沈志强*

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东滨州 256600;2.山东省畜禽用蜂胶疫苗工程技术研究中心,山东滨州 256600)

犬瘟热(Canine distemper,CD)是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的多种动物发生的一种急性、高度接触性传染病[1]。据资料报道,CDV能适应多种细胞培养物,如 Vero细胞、MDCK细胞、犬脑细胞、T淋巴细胞、鸡胚成纤维细胞、犬肺巨噬细胞等。且在不同细胞上的生物学特性也不尽一致[2]。本试验旨在通过了解CDV在不同细胞上的生长特性,以期寻找培养该病毒毒价高、病变明显的细胞,为疫苗生产及大量制备抗原物质提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

CDV种毒、Vero细胞和MDCK细胞均由山东省滨州畜牧兽医研究院预防兽医学与动物生物技术重点开放实验室保存,鸡胚成纤维细胞(CEF)自备。细胞培养生长液为DMEM,新生牛血清(FBS)为北京民海生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞的传代 Vero细胞的培养液为DMEM+60 mL/L FBS,CEF和MDCK细胞的培养液为DMEM+70 mL/L FBS;Vero细胞和MDCK细胞的培养方法为连续单层传代培养,CEF细胞为原代培养。

1.2.2 病毒增殖 取适量的CDV病毒液分别接种于长满单层的Vero细胞、MDCK细胞及CEF细胞后,置37℃培养箱中培养,逐日观察病变情况,当出现70%～80%细胞病变(CPE)时收获,冻存备用。

1.2.3 RT-PCR鉴定

1.2.3.1 引物 根据GenBank上发表的CDV F蛋白基因序列,DNAMAN比对CDV F蛋白基因序列,利用Primer 5.0在保守区设计1对引物,扩增目的片段大小为337 bp。

P1:5′-TGGTACTGGCAGGTGCAGCTTTAGG-3′;P2:5′-TCGGCTGAAATAGGATCACGTAAAC-3′,引物由上海生物技术有限公司合成。

1.2.3.2 RNA的提取 将CDV在MDCK细胞、CEF和Vero细胞连续传5代的培养物进行RTPCR扩增。其方法按参考文献[3]操作。

1.2.3.3 RT-PCR扩增 以提取的病毒基因组RNA为模板,首先反转录为cDNA。……