孙志勇邓镇涛 冯丽娟 宋明英

（遵义医学院珠海校区，珠海519041）

韭菜汁分离成分的抑菌作用研究*

孙志勇**邓镇涛 冯丽娟 宋明英

（遵义医学院珠海校区，珠海519041）

用D-101大孔树脂吸附层析法对韭菜汁进行初步分离，对韭菜原汁及其分离成分进行平板法体外抑菌实验。结果表明：韭菜汁对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌等4种供试菌都有抑制作用；大孔树脂分段分离成分中，蒸馏水洗脱成分对供试菌无抑菌能力，体积分数50%乙醇洗脱前段对4种供试菌均有较强的抑菌作用，体积分数95%乙醇洗脱段对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有抑制作用。

韭菜汁；大孔树脂；分离；抑菌活性

AbstractThis study is about separating the composition from Chinese Chives Juice with D-101 macroporous resin chromatography column,and the antimicrobial experiment for both Chinese Chives Juice and its separated composition outside body by means of the plate method. The results shows that Chinese Chives Juice has antimicrobial effect on Escherichia coli,P.aeruginosa,Staphylococcus aureu and Diarrhea bacillus,whereas the washed liquid in the separated composition with macroporous resin used has not antimicrobial effect on the four kinds of bacteria mentioned above.The washed liquid with 50%alcohol has antimicrobial effect on the supplied experimental viruses of the four kinds of bacteria mentioned above,and the washed liquid with 95%alcohol has antimicrobial effect on Escherichia coli and Staphylococcus aureu.

KeywordsChinese chives juice；Macroporous resin；separation；antimicrobial activity

韭菜（Chinese chives），在植物学上属百合科葱属，为一种多收的多年生宿根性辛香类蔬菜，大名起阳草、壮阳草、长生韭等。韭菜中含有蛋白质、脂肪、碳水化合物，还有丰富的胡萝卜素、Vc等维生素。韭菜汁对大肠杆菌、绿脓杆菌等几种常见致病菌有抑菌活性。因此，研究韭菜所含成分的抑菌能力有实际意义。大孔树脂吸附技术已广泛用于中药有效成分的提取、分离、纯化工艺，且越来越多的用于中成药制备工艺，且具有稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好和再生处理方便等优点。本文用大孔树脂为固定相，水和不同体积分数的乙醇为流动相对韭菜汁进行梯度洗脱，比较各洗脱部位成分对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌等4种菌的抑菌能力，为韭菜提取物的药用价值研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

大肠杆菌（Escherichia coli）、绿脓杆菌（P. aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、痢疾杆菌（Diarrhea bacillus），均由遵义医学院珠海校区微生物教研室提供；新鲜韭菜（购于广东珠海金海岸市场）；D-101型大孔树脂，天津市大钧科技开发有限公司；体积分数95%乙醇（分析纯）。

1.2 主要仪器设备

立式压力蒸汽灭菌器，江阴滨江医疗设备厂；BHC-1300IIA/B3生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；Scientz-10N冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；UV-2550紫外分光光度系统，日本岛津；超低温冰箱，海尔；JC303型电热恒温培养箱，上海成顺仪器仪表有限公司。

1.3 样品制备

1.3.1 韭菜汁的榨取

取新鲜韭菜500 g，用蒸馏水冲洗干净后，切成小段放入研钵中进行研磨，待韭菜磨成糊状后用干净纱布过滤，对滤液进行抽滤，得50 mL滤液放入4℃冰箱中静置12 h，取上层韭菜汁（相当于新鲜韭菜10 g/mL），备用。

1.3.2 大孔树脂的预处理方法

用体积分数95%乙醇湿法装柱，继续用体积分数95%乙醇冲洗树脂层，至流出液加水稀释不浑浊。然后用蒸馏水反复洗柱，直到柱子里的大孔树脂被洗成白色，即可投入使用。

1.3.3 样品分离

取1.3.1制备的韭菜汁10 mL，树脂柱上样后静置30 min，用45 mL蒸馏水进行洗脱，弃去前10 mL洗脱掖，然后按顺序收集洗脱液三段（每段10 mL），分别标记为样品①、②、③号。然后用45 mL体积分数50%的乙醇进行洗脱，弃去前10 mL洗脱液，再按每段10 mL收集洗脱液三管，分别标记为样品④、⑤、⑥号。再用45 mL体积分数95%的乙醇对柱子进行洗脱，弃去前10 mL洗脱液，再按每段10 mL收集洗脱液三管，分别标记为样品⑦、⑧、⑨号。

1.3.4 样品处理

对④～⑨号样品分别减压浓缩后，冷冻干燥，分别加入10 mL无菌蒸馏水溶解（相当于新鲜韭菜10 g/mL），4℃冰箱中备用。使用前将①～⑨韭菜汁样品用微孔滤膜过滤除菌。

1.4 抑菌实验

1.4.1 菌液的制备

从斜面上接种供试菌于肉汤培养基中，37℃培养18 h，将制备的菌液稀释至（106～107）个菌/mL。

1.4.2 制含菌平板及加样

按文献［6］、［7］的方法制备含菌平板：用融化的琼脂培养基10 mL倒于平皿中制成平板，用微量加样枪取一种供试菌80 μL，用灭菌涂棒迅速将菌液涂抹均匀制成含菌平板，每种供试菌制备9个含菌平板。将每个含菌平板分为4四个区，在各区中央打一小孔（d=0.70 cm），然后用无菌移液枪吸取各样品100 μL于不同小孔中，用无菌蒸馏水作为阴性对照。每个样品对每个菌种做3个平行板，于37℃培养箱中培养24 h，观察抑菌大小，记录结果。1.5紫外扫描

用UV-2550紫外分光光度计分别对抗菌实验样品①～⑨号，在200 nm～400 nm范围内进行步长为1 nm的紫外扫描，鉴定样品成分的紫外光谱特征。

2 结果与分析

2.1 抑菌实验结果（见表1）

表1 各样品对供试菌的抑菌作用（抑菌圈直径）

表1结果显示韭菜汁对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌都有抑制作用。韭菜汁的大孔树脂分离成分中，蒸馏水洗脱段（①～③号样品）对4种供试菌都无抑菌能力。体积分数50%的乙醇洗脱前两段成分（④、⑤号样品）对4种供试菌都有抑菌能力，④号样品对4种供试菌的抑菌能力明显比⑤号样品强；而⑥号样品对4种供试菌均无抑菌能力。体积分数95%的乙醇洗脱段（⑦～⑨样品），对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有抑菌能力，抑菌能力顺序为⑦号＞⑧号＞⑨号，显示有效抑菌成分随流出时间的推移浓度在降低，且这些成分对绿脓杆菌、痢疾杆菌供试菌都无抑菌能力。

2.2 紫外扫描结果

韭菜汁的蒸馏水洗脱部分①、②、③号样品的紫外光谱吸收曲线形状、峰位相似，说明韭菜汁的蒸馏水洗脱部分前、中、后段成分相同。体积分数50%乙醇洗脱部分④、⑤、⑥号样品及体积分数95%的乙醇洗脱段⑦样品的紫外吸收光谱峰形与蒸馏水洗脱部分的样品图谱形状明显不同，且每个样品的光谱图各有不同特征，说明体积分数50%乙醇不同洗脱段及体积分数95%的乙醇洗脱段⑦样品的主要分离成分不同。体积分数95%的乙醇洗脱段的⑧、⑨号样品的紫外吸收光谱，峰形状基本相同，但与①～⑦号样品的紫外吸收光谱都不同，⑧号样品光谱的峰高明显大于⑨号样品，说明⑧号、⑨号两个样品所含物质成分没有紫外吸收差别，峰高不同说明体积分数95%乙醇的这两个洗脱段所收集的主要成分浓度不相同。

3 讨论

本课题组前期研究韭菜汁在体外对常见致病菌的抑菌能力，发现韭菜汁的成分经高温处理后抑菌能力消失，说明韭菜汁中抑菌成分的热稳定性差。本实验研究韭菜汁大孔树脂分离成分对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌4种致病菌的抑菌能力，发现蒸馏水洗脱段成分对四种供试菌都无抑菌能力；体积分数50%的乙醇洗脱前两段成分对4种供试菌均有抑菌能力，而后段成分对4种供试菌均无抑菌能力；体积分数95%的乙醇洗脱段成分对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有抑菌能力，但对绿脓杆菌、痢疾杆菌供试菌无抑菌能力。用紫外扫描分析不同洗脱成分的紫外光谱特征，发现韭菜汁的体积分数50%乙醇不同洗脱段及体积分数95%的乙醇洗脱段⑦样品主要分离成分不同，体积分数95%乙醇洗脱段⑧号、⑨号两个样品主要分离成分相同，但浓度不同。表1数据表明韭菜汁的体积分数50%乙醇洗脱段成分与体积分数95%乙醇洗脱段成分的抑菌谱不同，说明韭菜中含有多种有效的抑菌成分，韭菜汁对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力是多种成分的协同作用，对绿脓杆菌和痢疾杆菌的抑菌能力活性成分较少，韭菜汁通过大孔树脂吸附层析法对韭菜汁进行初步分离是有效的。韭菜汁的体积分数50%乙醇不同洗脱段成分及体积分数95%乙醇不同洗脱段成分的抑菌能力不同，这可能与有效成分种类及浓度大小有关。由于本实验使用的是韭菜汁初步分离成分，所以韭菜抑菌活性成分的分离纯化和结构鉴定还需进一步研究。

［1］潘文亮.营养保健说韭菜［J］.河北农业科技，2002（8）：43.

［2］张玲，时延增，徐新刚.韭菜籽中氨基酸及微量元素的分析［J］.时珍国药研究，1999，7（1）：21.

［3］孙志勇，宋明英，韦坤德，等.韭菜汁对常见病原菌的体外抑制作用［J］.遵义医学院学报，2008，31（6）：584-586.

［4］何伟，李伟.大孔树脂在中药成分分离中的应用［J］.南京中医药大学学报，2005，21（2）：134-136.

［5］刘彬果，郭文勇，钟蕾，等.大孔吸附树脂在中药制剂中的应用［J］.解放军药学学报，2003，19（6）：452-455.

［6］李丽，蒋继志，孙琳林.几种复方制剂对四种植物病原真菌的抑制作用［J］.安徽农学通报，2006，12（9）：145-146.

［7］张军田.现代药理实验方法［M］.北京：北京医科大学协和医科大学联合出版社，1998：1 412-1 415.

Study on the antimicrobialeffect ofthe separated components from chinese chives juice

SUNZhi-yong**DENGZhen-taoFENGLi-juanSONGMing-ying
（Department ofchemistry，Zhuhai campus ofZunyi medical college，Zhuhai 519041，China）

遵义医学院珠海校区科研启动基金（KY200604）

**孙志勇，男，1968年出生，学士，副教授，主要从事药物化学及电化学研究。

2010-05-20