应奇才，徐祥彬，施农农，王慧中

(杭州师范大学 生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

近年来，西瓜病毒病日趋严重，严重影响了西瓜的产量和品质，给农业生产造成了重大的损失。报道显示，我国西瓜花叶病毒病的平均发病率超过30%，个别品种甚至高达100%，造成西瓜产量年平均减产30%～40%，经济损失高达1.5亿元左右。使用化学农药杀灭病毒传播介体 (如飞虱、叶蜱等)可以在一定程度上降低发病率。然而，对于病毒本身，由于其寄生于植株细胞内，与寄主细胞共存，人们难以找到既对病毒有杀伤作用又对寄主无损害的选择性化学药物。因此，选育西瓜抗病新品系或品种，对农业生产具有重要的理论和实践意义。

1999年，作者采用基因工程方法，利用西瓜组织培养和农杆菌转化技术成功地把WMV-2CP基因转入浙密2号西瓜，获得转基因植株［1］。经过10年的培养试验，获得了大量的转基因西瓜农艺性状资料。本文主要对转WMV-2CP基因西瓜后代农艺性状进行分析，以便为进一步推广转WMV-2CP基因浙密2号西瓜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

转西瓜花叶病毒2号外壳蛋白基因西瓜 R1、R2代种子。

1.2 方法

1.2.1 西瓜基因组DNA提取

以转WMV-2CP基因西瓜植株和未转化的西瓜植株为材料，利用 CTAB法提取基因组 DNA［2］，作为PCR扩增模板。

1.2.2 PCR检测转WMV-2CP基因西瓜后代分离及基因飘移情况

根据WMV-2CP基因序列设计并合成2条引物［3］(引物由上海 Sangon 公司合成)，W1:5′-TCC ATG GCA GCC AAG GAG AAG GAA GG-3′;W2:5′-TTG TCG ACA ACA AAC ATT GCC GCA-3′。以转WMV-2CP基因和未转基因的西瓜DNA为模板，PCR扩增WMV-2CP基因。PCR反应体系均为:10 × Buffer 5 μL，10 mmoL·L-1dNTP 2 μL，PCR引物各25 mol，DNA 模板 1 μL(约 200 ng)，Taq酶2 U，加灭菌双蒸水至50 μL。PCR反应步骤为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，循环33次;最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 转基因植株病毒抗性检测

WMV-2按常规方法摩擦接种于西葫芦幼苗的子叶上，测定鉴别寄主的反应。接种20 d出现病叶发皱、叶缘锯齿状、叶片有浓绿疱状突起等典型症状后，收集病叶，提纯 WMV-2［4］。病毒制剂作适当稀释后进行紫外吸收光谱测定，最低吸收峰在245 nm，最高吸收峰在260 nm，基本显示一个核蛋白吸收光谱，磷钨酸负染电镜观察表明，病毒粒为长约750 nm的柔性线条状结构。

转基因植株和阴性对照植株采用对比法种植，4月中旬播种，试验地点分2组，1组在中国水稻研究所防虫温室，另1组在西瓜种植试验区。4月下旬利用汁液摩擦接种病毒，检测3个转基因株系的抗病效果。温室及大田试验均设2次重复。

1.2.4 农艺性状分析

转基因浙密2号西瓜田间试验主要对供试材料长势、生物学性状、含糖量、越冬能力以及产量等各项农艺性状进行观察记录。

2 结果与分析

2.1 外源基因的飘移

取转基因西瓜试验区内其它植株80个样品，对其进行PCR分析，结果没有扩增出WMV-2外壳蛋白基因的特异性条带。取转基因西瓜试验区10 m外其它植株60个样品，对其进行PCR分析，没有扩增出WMV-2CP基因的特异性条带。取转基因西瓜试验区20 m外普通西瓜植株30个样品，对其进行PCR分析，3个样品扩增出WMV-2外壳蛋白基因的特异性条带。取转基因西瓜试验区100 m外普通西瓜植株30个样品，对其进行PCR分析，没有扩增出WMV-2外壳蛋白基因的特异性条带。

可见，本试验为了防止目的基因扩散而采取的100 m内种植高杆植物，或以河流和建筑物隔离以防外源基因扩散的措施是有效的。

2.2 转基因西瓜WMV-2CP基因的后代分离

PCR检测结果表明，WMV-2外壳蛋白基因在转基因自交子一代西瓜植株的分离比符合孟德尔3∶1的比例 (表1);由R1代植株自交得到R2代植株的WMV-2外壳蛋白基因的分离结果也符合孟德尔1∶2的分离比 (表2);R3代转基因株系大部分为WMV-2外壳蛋白基因的纯合体 (表3);R4代植株WMV-2外壳蛋白基因的纯合度比R3代植株更高 (表4);R5代植株 WMV-2外壳蛋白基因的分离结果表明R5代植株为WMV-2外壳蛋白基因的纯合体 (表5)。通过以上试验结果分析可知，转WMV-2CP基因西瓜的病毒抗性为显性单基因遗传，即转WMV-2CP基因西瓜的WMV-2CP基因为显性单基因遗传。

表1 转基因R1代植株WMV-2CP基因的分离

表2 转基因R2代植株WMV-2CP基因的分离

表3 转基因R3代植株WMV-2CP基因的分离

表4 转基因R4代植株WMV-2CP基因的分离

表5 转基因R5代植株WMV-2CP基因的分离

2.3 转WMV-2CP基因西瓜病毒抗性

抗病性试验结果表明，对照植株接种西葫芦病叶汁液后，主要表现为花叶，顶部叶片出现浓、淡相同的绿色斑驳，病叶细窄、皱缩，植株矮小、萎缩，花器发育不良，不易坐果，即使结果，瓜也较小，接种的20株对照株平均单果重仅4.1 kg。而转基因 R1、R2、R3、R4、R5代植株 (各 30株，T7、T11和T32各10株)接种西葫芦病叶汁液后发病时间明显迟于对照株。转化株T7平均接毒后45 d开始发病，转化株T11平均接毒后40 d开始发病，而转化株T32平均接毒后65 d才开始出现病症，表现出对WMV-2的高度抗性，30株转化株都能正常开花结果。

将转基因西瓜3个株系的第5代植株进行病毒接种，观察接毒情况和病情发展。结果表明，转基因植株的T5代株系于3叶期人工接种 WMV-2，接种后20 d开始调查发病情况，接种40 d左右达到发病高峰 (表6)。另外，西瓜采收时选取12株抗病性和农艺性状好的单瓜繁殖下一代 (T7、T11、T32各4株)，抗病毒鉴测结果表明转化株可以大大延缓发病时间，减轻发病程度。

表6 接种后40 d转基因R5代植株发病情况

2.4 转WMV-2CP基因阳性西瓜植株长势、生物学性状、含糖量及越冬能力

观察结果表明，转基因西瓜与未转基因植株在长势、生物学性状以及含糖量之间没有明显的差异，其越冬能力和农艺性状也没有明显差异。

2.5 产量分析

与未转基因西瓜植株相比，不同的转基因株系的瓜数、单瓜重以及产量均有不同程度的提高。其中株系R5T32瓜数较对照增加17.26%，单瓜重增加41.95%，产量增加18.86%(表7)。

表7 转基因西瓜产量的变化

3 小结和讨论

由以上的试验结果可知:转WMV-2CP基因浙密2号西瓜的抗西瓜花叶病毒的能力，相比浙密2号有显著的提高，其中转基因阳性株系 T32效果最好。其它阳性株系的农艺性状与对照相比有一定的提高，但没有显著差异。因此，经过进一步食品及环境安全性评价，转基因阳性株系T32可进行生产性试验和推广应用。

［1］王慧中，赵培洁，周晓云.农杆菌法转化获得转基因西瓜植株 ［J］.浙江大学学报:农业与生命科学版，2000，26(1):111－113.

［2］Rogers S O，Bendich A J.Extraction of DNA from milligram amounts of fresh，herbarium and mummified plant tissues［J］.Plant Mol Biol，1985(5):69 －76.

［3］刘俊君，彭学贤，莽克强.大豆花叶病毒基因组3′-端区域的克隆和序列分析 ［J］.生物工程学报，1992，9(3):201－204.

［4］Francing W.Purification and identification of a South African isolate of watermelon mosaic virus-Moroccs［J］.Phytopathology，1987，120:255－270.