河南金丹乳酸有限公司乳酸工程技术研究中心崔耀军张国宣南京工业大学制药与生命科学学院虞龙

低能离子注入L-乳酸生产菌生物学效应的研究*

河南金丹乳酸有限公司乳酸工程技术研究中心崔耀军张国宣
南京工业大学制药与生命科学学院虞龙

乳酸是目前世界上公认的3大有机酸之一，其广泛应用于食品、医药、化工、制革、纺织、环保和农业等诸多领域。目前随着白色泡沫污染日益严重，可生物降解的聚乳酸产品作为有可能取代造成环境污染的白色热塑产品也越来越受到人们的关注。目前，化学合成法生产乳酸均为DL型，无法达到聚L-乳酸的要求。而用微生物发酵法生产L-乳酸可以得到较高的纯度要求。本研究以低能氮离子注入L-乳酸菌，筛选到一株产量比出发菌株提高10%的高产株RS12-6c。

一、材料与方法

1.菌种。凝结芽孢杆菌Bacilluscoagulans，中国菌种保藏中心。

2.培养基。基本培养基(g/L)：胰蛋白胨10，牛肉膏3，酵母膏3，葡萄糖5，MgSO4·7H2O0.5。

筛选培养基：高葡萄糖平板：基本培养基中加30%葡萄糖。纯乳酸平板：以0.5%的乳酸代替基本培养基中的葡萄糖。琥珀酸平板：以2%的琥珀酸代替基本培养基中的葡萄糖。种子培养基（g/L）：葡萄糖60，酵母膏10，蛋白胨10，MgSO4·7H2O 0.5。发酵培养基（g/L）：葡萄糖150，酵母膏15，蛋白胨5，MgSO4·7H2O 0.5。

3.低能离子注入工艺与样品处理。取培养20h的种子液稀释10倍，取0.1mL均匀涂布于无菌平皿上，以无菌风吹干。取镜检无细胞重叠者进行离子注入。离子注入机为LZD900多功能离子注入机（本研究室配备），使用以20keV氮离子不同剂量进行注入，靶室真空度为10-3Pa。将平皿置于靶台上，以5s脉冲式注入，间隔15s，然后取出平皿，以1mL无菌水洗脱，涂平板培养基，于45℃培养2～3天用于单菌落的挑选和存活率的计算。

4.筛选方法。

（1）初筛。将经离子束注入后的平板用无菌水洗下，涂布于高糖平板。将生长状况良好的菌株用牙签挑到高乳酸平板上，筛选能生长的菌株，然后将筛选的菌株挑到琥珀酸平板和纯乳酸平板上进一步筛选。筛选在琥珀酸平板上比出发菌株延迟出现菌落的菌株，即强化EMP途径、减弱TCA循环的变异株。筛选在纯乳酸平板上不生长，即筛选出不分解利用乳酸的菌株。

（2）复筛。将初筛获得的菌株经种子培养基后转入发酵培养基逐个发酵，进行产量测定。

5.突变率的计算。取接受辐照后的单菌落分别进行发酵实验，同时以出发菌作为对照，考察菌株的产酸能力。其中产酸比出发菌株低5%的视为负突变菌株，大于5%为正突变菌株，在5%以内的视为无义异株。负突变率是指负突变菌株占全部被考察的菌株的比率，正突变率指正突变菌株占全部被考察的菌株的比率。

6.分析方法。

（1）pH值测定。采用上海雷磁pHS-3B型精密pH计。

（2）菌体浓度测定。采用分光光度法。

（3）发酵液中乳酸钙的测定。采用EDTA滴定法。

（4）乳酸含量测定。采用高效液相色谱法。

二、结果与讨论

1.存活曲线。从存活率曲线上可以看出其与文献报道的“马鞍形”曲线基本吻合，但不同之处是在实验中存活率的第一次下降不是缓慢的，而是在很低的剂量下就出现了存活率的骤降。还有一点与其他类似菌种注入报道不同，曲线上出现了两个峰。在低剂量时存活率急剧下降，随着剂量的增加，存活率有短暂回升，后又逐渐下降，但在中高剂量下又有缓慢的回升最后再逐渐下降。而且笔者在20keV及其他能量下多次试验均发现这种现象。

图1 N+离子注入凝结芽孢杆菌的存活率曲线

相关研究指出，离子注入细胞的射程较短，低剂量时离子只对细胞表面进行损伤和刻蚀，能量沉积所产生的大量自由基亦会导致DNA和生物膜等其他生物大分子的损伤，从而都造成存活率下降。针对图1出现存活率的两个短暂回复峰，笔者认为可能是菌体内修复酶的激活及注入电荷积累形成的“保护屏障”，在时间上存在着先后差别，从而使存活率出现两个回复峰。

2.菌种筛选。将经过筛选平板挑出的菌株，经种子培养基培养后，转入发酵培养基逐个发酵，进行产量测定。同时与出发菌株对照计算突变率。挑取产酸高的菌株，进一步发酵验证。得到的高产菌株，经遗传稳定验证后，进入下一轮诱变筛选。

图2 N+离子注入凝结芽孢杆菌的突变率

由图2可以看出在剂量范围在100×1013ions/cm2～200× 1013ions/cm2之间时正突变率比较高。经20keVN+离子注入，筛选出1株高产突变菌株，其L-乳酸生产能力有了显著的提高，将其命名为Bacillus coagulans RS12-6C。

为了确保筛选到的高产菌BacilluscoagulansRS12-6C的遗传稳定性，对其做了遗传稳定性考察。每代实验过程：高产菌株自然分离→单菌落→斜面→种瓶→摇瓶发酵，测L-乳酸产量。共传5代，每代均做3个平行样，结果见表1。

表1 高产突变株遗传稳定性实验

由表1可以看出，在投糖15%的情况下，产酸基本维持在117g/L左右，说明该菌遗传稳定性较好。

3.发酵培养基优化。

（1）碳源对发酵的影响。分别以含糖量为150g/L的葡萄糖、大米糖化液、玉米粉糖化液、木薯粉糖化液作为发酵培养基的碳源，其他组分均相同进行发酵。其中，大米、玉米粉及木薯粉均采用高温淀粉酶及α糖化酶进行双酶水解后补足葡萄糖使用。在45℃进行发酵72h后，测L—乳酸产量。

研究表明，葡萄糖、大米糖化液、玉米粉糖化液对L—乳酸发酵影响相差不大，蔗糖基本不能被利用发酵，其中葡萄糖为最佳碳源。从原料来源和成本角度考虑，本研究采用玉米粉糖化液为碳源。

（2）不同氮源对发酵的影响。乳酸发酵属于初级代谢过程产酸量随着菌体的增长迅速增加，发酵时添加的氮源过少，不利于菌体生长，发酵产酸减少。但加入的营养物质过多，菌体生长过于旺盛，发酵速度快，但菌体消耗过多的营养用于生长，产酸的量下降。以发酵培养基为基础加入含氮量大致相同的不同氮源进行发酵培养，分别为酵母膏1.5%、蛋白胨1.5%、豆粕水解液2%、玉米浆1.5%、棉籽蛋白2%，于45℃发酵72h。

结果表明，酵母膏是该菌发酵的最适氮源。可能是由于该菌是营养缺陷型，而酵母膏中富含丰富的氨基酸、维生素等活性因子有利于菌体生长及产酸。但酵母膏成本太高在大规模发酵中不可能使用，可以考虑增加其他氮源减少酵母膏用量或寻找更佳的可替代酵母膏的氮源，这也是下一步需要进行的工作。

4.发酵培养条件优化。

（1）摇床转速对产酸的影响。实验分别以静置，50rpm，100rpm，150rpm，200rpm转速，发酵至终点，测产酸。

结果表明，在50rpm下振荡培养比其他转速及静置培养产酸都高。由此可见该菌是兼性厌氧菌，在有少量氧存在的情况下可促进菌体生长及乳酸的产生。但文献报道乳酸多在静止发酵。故又设计如下实验：分别以0rpm，50rpm，100rpm，150rpm，200rpm各转速下，先震荡6h，12h，18h后转入静置发酵，共13种发酵方式。结果表明，100rpm摇床振荡12h后转入静置培养，产酸最高。可能是由于该菌是兼性厌氧菌，在发酵前期通入少量分子氧，使菌体浓度迅速增长。然而，L-乳酸的发酵机制为葡萄糖经EMP途径生成丙酮酸，丙酮酸在L-乳酸脱氢酶的作用下生成乳酸，这一过程在厌氧条件下能够较好的实现。故当菌体浓度达到一定程度后转入厌氧发酵，可使乳酸产量迅速积累。

（2）温度对发酵的影响。有文献报道凝结芽孢杆菌属于嗜热菌在微通氧情况下其生长温度可达75℃以上。分别在不同温度下发酵测L-乳酸产量，实验结果表明，在45℃到60℃之间产量基本比较稳定，其中以55℃为最好。故确定最佳发酵温度为55℃。在这一温度下，普通细菌尤其是发酵中易混入的德氏乳杆菌难以生长，减少了染菌的机会，从而可以较好地保证产物的光学纯度及以后在大罐发酵中可以减少冷凝水用量。

5.高产菌株发酵特性。将经过多轮筛选获得的L-乳酸高产菌株RS12-6C在以上优化基础上进行发酵培养，每隔6h观察培养并取样检测绘制发酵曲线。

实验表明，由于发酵瓶中加入过量轻质碳酸钙，整个过程pH值基本维持在6.8左右，而此pH值是凝结芽孢杆菌生长及产酸的较佳范围。从OD值的变化可以看出，菌体生长速度较快，24h后OD值已经达到最大，此时菌种亦进入高速产酸阶段。乳酸发酵属于初级代谢过程，随着生物量的积累，L-乳酸产量迅速增长。54h达到发酵终点时，产酸量达到约117g/L，转化率达到80%左右。

三、结论

通过运用离子注入技术诱变选育L-乳酸生产菌凝结芽孢杆菌，总结离子束注入微生物的生物学效应，在工业微生物遗传改良的新方法上进行了初步有益的尝试。经多轮离子注入筛选到一株高产突变菌株RS12-6C，与出发菌株相比产酸性能提高了约10%，其L-乳酸产量达到117g/L左右。同时，对RS12-6C的发酵条件进行了初步优化，确定了碳氮源浓度、发酵温度及控氧条件，为进一步发酵罐上条件研究提供了参考依据。

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国家高技术研究发展计划（863计划）引导项目（2005AA001180）。