朱培坤 ，李朝阳 ，李 菁 ，李 鹂

（1.深圳市百绿生物染色体杂交研究所，广东 深圳 518172；2.吉首大学植物资源保护与利用湖南省高校重点实验室，湖南 吉首 416000）

野生近缘杂交是优良农艺性状获得的重要途径之一，通过种间杂交及后代选育，可得品质优良的作物新品种。远缘杂交是属以上的种间杂交，容易存在杂交不亲和及后代不育等现象，给新品种育种带来困难。近期在植物属间远缘杂交方面取得了很大的进展，目前已在多个属间如小麦属与黑麦属[1]、偃麦草属[2]、草莓属[3]，动物如鸡与鹌鹑等[4]的属间远缘杂交取得了成功。远缘杂交的成功给农作物杂种生产，改良农作物品质带来了曙光。

豌豆属蝶形花科豌豆属植物，玉米属禾本科玉米属植物，二者分属双子叶植物纲和单子叶植物纲。近期有学者尝试将豌豆与玉米进行了远缘杂交，并获得了可育的后代[5]。研究其杂种后代的遗传基础，对评价其杂种后代真实性以及进一步研究利用有重要意义。

相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism,SRAP）是一种新的DNA分子标记，具有简便、稳定、中等产率和容易得到选择条带序列等特点，广泛应用于图谱构建、性状的标记、遗传多样性分析以及杂交后代真实性的鉴定[6]。本实验对豌豆和玉米杂交后代进行SRAP分析，检测其杂交后代的真实性，以期为该杂交后代的合理开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供体豌豆（Py）、受体玉米（MF、M540）、杂交后代（Py-MF和Py-M540）种子都由深圳百绿生物科技有限公司提供[5]。试验于2008年4月将5个供试种进行播种，生长期记录生长状况，7月采集各植株叶片进行相关试验。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取5个类型植株的叶片混合，改良CTAB法提总DNA。

1.2.2 PCR扩增及检测 从42对SRAP引物中筛选出10对引物进行扩增（引物序列见表1）。扩增程序为：94℃ 预变性 5 min；94℃ 变性 1 min，35℃复性1 min,72℃延伸1 min，5个循环；94℃变性1 min，50℃复性 1 min，72℃延伸 1 min，35 个循环；最后72℃延伸10 min。用1%的琼脂糖电泳检测扩增产物，电泳结束后在英国UVP公司的GDS 7500凝胶成像系统中成像，拍摄并保存结果。

表1 试验所用SRAP引物

1.2.3 数据统计和分析 将电泳得到的扩增图谱的每一条带都代表引物的结合位点。有扩增条带记为1，无带记为0，强带和弱带的赋值都为1。对于多态位点，将在重复试验中能稳定出现的差异带用于数据分析。利用GenePOP软件对RAPD分析所得到的表型矩阵进行遗传参数分析。仅计算Nei′s遗传距离（D），并根据 Nei′s遗传距离，利用 GenePOP 软件的UPGMA法分析居群间的遗传关系。

2 结果与分析

2.1 玉米生长期形态差异观察

如图1所示，从幼苗开始，Py-M540的茎尖严重右向卷曲，导致茎尖横向生长，故植株矮小且节间短，茎秆瘦弱，株高仅为受体M540的一半，但成熟叶片与受体M540的叶形无差别，M540的茎尖也有轻微卷曲，但仍然向上生长。而同一供体的另一杂交后代Py-MF则表现出与Py-M540完全不同的形态特征：长势强壮，叶片短而宽大，叶片基部夹角非常小，几乎与茎秆平行的成簇上伸，并不卷曲，节间非常短，其受体MF的茎尖也不卷曲，叶片长而宽，节间长。

图1 受体玉米及其杂交后代的生长期形态特征

2.2 10对引物对豌豆和玉米及其杂交后代的扩增结果

对42对SRAP引物进行筛选扩增，最终选择了扩增条带清晰，多态性强的10对引物对Py、MF、M540、Py-MF和Py-M540进行了扩增，共获得105条重复性高的清晰条带，其中有101条为多态，多态比率（PPB）为96.19%。

2.3 供体和受体基因在2个杂交后代中的表达

10 对引物中，me1-em9、me1-em3、me1-em4、me2-em1和me4-em8 5对引物在Py-M540和Py-MF中扩增出双亲特异带（图2）。在Py-MF和Py-M540中出现了Py的特征带（图中箭头所指），表明2个后代具有双亲的遗传物质，豌豆的遗传物质进入了玉米基因组，此结果从DNA分子水平上初步证实了Py-M540和Py-MF可能是豌豆和玉米杂交的真实后代。

图2 豌豆和玉米杂交后代的SRAP验证

2.4 SRAP标记的聚类分析

根据SRAP引物扩增结果，对5个样本进行了遗传距离计算和聚类分析（表2，图3）。观察等位基因数na=1.961 9，有效等位基因数ne=1.629 3，Nei基因多样性指数h为0.370 3。从遗传距离比较来看，Py-MF与Py-M540的距离最近，与其亲本MF的距离次之，与供体Py的距离最远。同样，Py-M540与其亲本M540的关系次于它与Py-MF的关系距离。以Nei的遗传距离为基础作聚类图，大致可分为3个聚类群，其中供体PY单独列为一群，2个受体M540和MF列为一群，供体与2个受体的后代PY-M540和PY-MF单独列为一群。这说明杂种后代的DNA序列发生了改变，导致后代与亲代间的从属关系变成了并列关系。从扩增结果中后代有Py基因的表达，表明这种改变极有可能来自豌豆基因的插入。

表2 遗传距离

表2 遗传距离

注：1——PY、2——M540、3——MF、4——PY-M540、5——PY-MF。

pop ID 12345****12345****1.475 9 0.965 1 1.286 7 1.098 6****0.363 5 0.405 5 0.405 5****0.495 1 0.297 3****0.259 5

图3 遗传距离聚类图

3 结论与讨论

在异源多倍化早期染色体片断变化是一个比较普遍现象，这可能有利于实现新合成物种快速进化[7]。在染色体分裂的某一特定时期，外源染色质的加入导致受体细胞不能识别，外源染色质顺利参与了受体细胞的有丝分裂和减数分裂，从而出现具有外源核小体与受体核小体两种核小体形成的螺线体和超螺线体[5]。而这种导入极有可能是因为DNA序列在不同染色体组之间迅速变化所造成，这种DNA序列的变化在具有AABB染色体组的四倍体小麦中注入节节麦的DD染色体组形成异源六倍体小麦的早期阶段被证实。本试验利用SRAP引物扩增分析表明2个杂交后代的DNA序列也发生了改变，亲本之一的玉米表达出来的条带在2个杂种后代中基本都有表达，较少消失。此外，2个后代还产生了大量的新带，多数更与豌豆相似，后代产生的条带多样性远远高于各自的亲本，也说明了后代的DNA序列确实发生了改变。

近年来，作为一种新型分子标记，SRAP在物种遗传多样性及远缘杂交特别是属间杂交的后代鉴定中得到广泛应用。薛丹丹等[8]利用SRAP标记对结缕草属杂种后代的鉴定研究表明，杂交后代的基因重组导致扩增条带丰富的变异，表现为条带的增加或缺失，且后代中有父本特征带的，鉴定为真实杂种后代。高丽霞等在用SRAP标记分析姜花属间杂交育种时发现，亲缘关系太近或太远（均值0.4～0.6），都会在后代中受自交不亲和性影响，而降低结实率，由此说明遗传距离的远近或许是属间远缘杂交成功的一个重要影响因子。本试验所用材料是不同纲间的种类杂交，但结果表明，2个杂种后代除了保持各自受体玉米的特征带且较少消失外，还产生了大量新带，其中一些条带与供体豌豆的特征带一致，可以证明2个杂交后代DNA序列的改变来自于豌豆基因的插入，是豌豆和玉米的真实杂交后代。

[1]张连全，刘登才，颜泽洪，等.远缘杂交早代稳定小麦导入了外源DNA片段并发生了DNA重排[J].中国科学C辑：生命科学，2005，35（4）：318-325.

[2]Xiaorong Shen,Herbert Ohm.Molecular mapping of Thinopyrumderived Fusarum head blight resistance in common wheat[J].Mol Breeding,2007,20（2）：131-140.

[3]马洪翔，陈佩度，余桂红，等.利用GISH和RAPD检测黄毛草莓×凤梨草莓种间杂种 [J].植物遗传资源学报，2005，6（3）：256-261.

[4]米拉古丽，阿米娜，姚守秀，等.利用SRAP标记分析鸡、鹌鹑及其属间杂交种的群体遗传结构[J].黑龙江畜牧兽医（科技版），2010，（5）：1-3.

[5]朱培坤.高等植物的第三类杂交——染色体杂交[J].中央民族大学学报（自然科学版），2009，18（1）：5-10.

[6]于 晖，赵 泓，王力超，等.百合杂交后代的亲本基因型鉴定[J].西南大学学报（自然科学版），2010，32（6）：58-63.

[7]耿广东，张素勤，贾开家，等.提莫菲维小麦与葡萄牙野燕麦远缘杂交后代的SRAP分析 [J].华北农学报，2010，25（1）：110-112.

[8]薛丹丹，郭海林，郑轶琦，等.结缕草属植物杂交后代杂种真实性鉴定——SRAP分子标记[J].草业学报，2009，18（1）：72-79.