施越冬 郭银铃 徐剑炜

(复旦大学附属中山医院整形外科,上海 200032)

软骨组织是人体内重要的支撑结缔组织,但软骨缺损的自身修复能力有限,组织工程技术[1]为软骨的修复重建提供了一个新的发展方向。纤维蛋白由于其良好的可塑性、黏附性和生物相容性而成为组织工程软骨的主要支架材料[2]。纤维蛋白凝胶作为软骨细胞支架材料存在生物强度差和降解过快的缺点。本研究拟探讨利用碳化二亚胺(EDC)增加纤维蛋白凝胶的交联度、生物强度和抗降解能力的可能性,旨在更好地构建可注射性软骨。

1 资料与方法

1.1 实验相关试剂 纤维蛋白原冻干粉,凝血酶(Sigma),DMEM 培养液,胎牛血清(韩国吉诺),磷酸盐缓冲液(PBS),II型胶原酶(Sigma),EDC(Pierce),0.4%台盼蓝(Sigma),LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit(Molecular Probes Inc),抗生素溶液：PBS液中含有青霉素 1000 U◦mL-1,链霉素1000 U ◦mL-1。

1.2 软骨细胞 选自3月龄的猪耳廓软骨。

1.3 主要实验器材 无菌6孔培养板,骨蜡(强生),YHZ-22型恒温振荡器(江苏太仓华美实验设备厂),恒温细胞培养箱,TDL-408B台式离心机,光学显微镜(Olympus),荧光显微镜(Olympus),超净台等。

1.4 实验方法

1.4.1 EDC与纤维蛋白原反应成胶的实验条件

1.4.1.1 (1)凝胶样本的制备实验分成2大组：(1)纤维蛋白原用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制成100 mg◦mL-1,凝血酶 50 U◦mL-1,EDC按照与纤维蛋白原不同的比例(1/10～10/10)的配比加入,按上述配好的纤维蛋白原溶液与凝血酶各1 mL加入骨蜡小格中,同时加入按上述分组称量好的EDC,加入试剂同时用细针轻轻搅拌,观察不同组别的凝胶化情况。(2)纤维蛋白原冻干粉用含10%胎牛血清的DMEM培养液分别配制成100 mg◦mL-1、200 mg◦mL-1,EDC用含10%胎牛血清的DMEM 培养液配制成10 mg◦mL-1、20 mg◦mL-1、30 mg ◦mL-1、100 mg◦mL-1、200 mg ◦mL-1、300 mg◦mL-1的溶液。将配好的不同浓度的EDC溶液与纤维蛋白原溶液各1 mL加入骨蜡小格中。并分别置于室温和37℃水浴中反应,观察不同组样本的反应情况。对照组：纤维蛋白原200 mg◦mL+凝血酶100 U◦mL。

1.4.1.2 凝胶块的水解稳定性检测 将第1步各组反应所得到的凝胶块用PBS缓冲液漂洗2遍后置于无菌6孔培养板,各加入等量的含10%胎牛血清的DMEM 培养液,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中,隔天换液,观察样本及培养液的变化情况。

1.4.1.3 凝胶块的酶解稳定性检测 按前1步试验得出的比较理想的配比,制备10 mm×10 mm×5 mm大小的凝胶块,PBS漂洗后,置于6孔培养板,各加入5 mL 0.1%Ⅱ型胶原酶。置于37℃恒温培养箱,观察凝胶块的消化降解情况,记录样本完全降解的时间。

1.4.1.4 按上步实验检测结果,选用较为理想的配比制备成同样大小的凝胶块,固定干燥后,送检电镜扫描,查看样本的超微结构,并估计测量孔隙大小。

1.4.2 软骨细胞在EDC交联的纤维蛋白凝胶支架中的生长情况

1.4.2.1 猪耳软骨细胞的获取 选用3个月龄体质量约50 kg猪耳廓软骨,经麻醉、消毒,切取猪耳,剥除皮肤筋膜及软骨膜,切成直径＜1 mm的软骨颗粒,用0.05%Ⅱ型胶原酶消化16 h,收集细胞,台盼蓝染色检查细胞活力、计数。

1.4.2.2 体外软骨组织工程样本的制备 (1)用含10%胎牛血清的DMEM培养液制备(200 mg纤维蛋白原+5×106细胞)◦mL-1的纤维蛋白原细胞悬液。EDC分别用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制成100 mg◦mL-1,200 mg◦mL-1,300 mg◦mL-1。(2)制作骨蜡小格,规格为5 mm×10 mm×10 mm。(3)将配好的纤维蛋白原细胞悬液分别与不同浓度的EDC溶液(各取200μL)加入骨腊小格中。加入试剂同时用细针搅拌均匀,置于37℃温箱中反应6个h,每隔1 h搅拌1次,待标本凝结后撤去骨蜡。

1.4.2.3 各组样本制作好后放入6孔培养板,加入等量含10%胎牛血清的 DMEM 培养液,置于37℃、5%CO2培养箱培养。每天换液,观察凝胶块的变化,倒置光学显微镜下观察细胞的生长情况及纤维蛋白凝胶的降解情况。

1.4.2.4 实验的第 1,第 4,第 7,第10天,不同组别的标本各取1块,用 LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit对凝胶块进行荧光染色,染色30 min后用PBS缓冲液漂洗2次。操作过程中严格注意避光,防止荧光淬灭。染色完毕后,将样本置于玻片上,于正置荧光显微镜下观察细胞的活力情况,用蓝光激发可见活细胞呈绿色,用绿光激发死细胞呈红色。

2 结 果

2.1 第1组实验发现EDC/纤维蛋白原＞2/10的组别不能形成凝胶 凝胶化的强度均较对照组差,放入培养箱培养,1周内均完全降解。

2.2 第2组实验结果发现在37℃反应条件下,如表1的配比可形成比较理想的凝胶。

2.3 按表1分组配比制成10 mm×10 mm×5 mm大小的凝胶样本,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液、37℃培养箱中培养。连续观察1个月,各组培养液无浑浊,凝胶块的大小和形态均无任何变化。

表1 4组凝胶组成配比

2.4 酶解稳定性检测 按表分组制成10 mm×10 mm×5 mm大小的凝胶块,每组各加入5 mL 0.1%Ⅱ型胶原酶,结果示对照组消化4 h后凝胶块完全降解,实验组(1)17 h完全降解,实验组(2)和实验组(3)消化24 h后凝胶块仍未完全降解。

2.5 电镜扫描结果 对照组为疏松多孔的网状结构,结构不规则,孔隙大小约为50～150 μ m。实验组的超微结构较对照组明显紧致有序,且实验组(1)＜实验组(2)＜实验组(3),孔隙大小分别为50～100μm、20 ～ 50μm和 10 ～ 30μm。

2.6 组织工程软骨样本体外培养结果

2.6.1 培养第1天,倒置显微镜下观察,见各实验组样本内细胞分布均匀,形态完整。活细胞荧光检测见各样本细胞生存良好,实验组(3)见少量死细胞。

2.6.2 培养第4天,倒置显微镜下观察,见实验组(1)的细胞仍保持着完整的细胞形态,实验组(2)可见部分细胞呈空泡状,实验组(3)细胞几乎都是空泡状。活细胞荧光染色检测示对照组和实验组(1)细胞活力良好,实验组(2)见较多的死细胞,实验组(3)凝胶块中未见存活细胞。

2.6.3 培养第7天,对照组凝胶块表面呈白色絮状物,光学显微镜下见培养液中有少量游离的细胞。活细胞荧光检测见对照组和实验(1)组细胞存活良好,实验(2)组大部分细胞死亡。

图1 纤维蛋白原200 mg◦mL-1,凝血酶 100 U◦mL-1,荧光显微镜观察(×10),第7天

2.6.4 培养第10天,对照组凝胶块体积减小了约1/4,强度下降明显,培养板底部见较多的白色絮状物,倒置光学显微镜下见培养液中游离细胞增多。实验组(1)凝胶块形态和强度仍无明显变化。活细胞荧光检测示2组样本内细胞存活良好。

图2 纤维蛋白原200 mg◦mL-1,EDC100 mg◦mL-1,荧光显微镜观察(×10),第7天

图3 纤维蛋白原200 mg◦mL-1,EDC200 mg◦mL-1,荧光显微镜观察(×10),第7天

3 讨 论

3.1 凝血酶通过酶解纤维蛋白原,使其α和β链释放出纤维蛋白A肽和B肽,从而改变纤维蛋白原分子的电荷和构象,形成有活性的纤维蛋白单体,纤维蛋白单体通过氢键及静电引力作用聚合成纤维蛋白凝胶。EDC作为蛋白交联剂,通过与氨基反应形成可与氨基反应的O-酰基脲中间体进行快速多肽缩合反应。凝血酶本身是多肽蛋白,当EDC和凝血酶同时存在时,EDC同样可作用于凝血酶,改变其分子结构,抑制其活性,EDC亦可作用于纤维蛋白原,阻碍其释放肽链而不能被激活。因此在第1大组实验中,各组反应难以凝胶化或仅在EDC浓度较低时形成稳定性差的凝胶。

3.2 EDC作为交联剂广泛应用于化工行业,近年来逐渐在组织工程学上的应用。EDC分子呈线性结构,作为多肽缩合剂和交联剂,可用于羧基和氨基的缩合反应。EDC通过与氨基反应形成O-酰基脲中间体,可进一步与氨基反应形成多肽聚合物,或在N-羟基丁二酰亚胺(NHS)存在时进一步与羧基基团反应生成酯化物,增强了交联效应。但是NHS溶液呈酸性,细胞生长条件难以控制,不适用于构建可注射性软骨,因此在本研究中未用NHS。EDC交联过程中不进入材料基质,而是生成水溶性的脲衍生物,细胞毒性小。目前EDC主要用于三维支架材料的交联制备,近年来在人工真皮[3]、角膜[4]、血管内皮、软骨等组织工程支架的实验研究中已证明EDC作为交联剂制备组织工程支架材料的可行性。

3.3 传统的纤维蛋白凝胶作为细胞支架材料存在着生物强度差和降解时间过快的缺点。EDC通过与纤维蛋白分子上的氨基和羧基反应,使分子间相互反应聚合,形成比传统纤维蛋白凝胶更为稳定的化学结构。本研究结果表明,EDC交联形成的纤维蛋白凝胶比传统纤维蛋白凝胶有更好的生物强度,置入模拟细胞生长条件的环境中仍保持较好的稳定性。进一步使用II型胶原酶对样本进行消化降解检测不同组别的酶解稳定性,结果表明EDC交联形成的纤维蛋白凝胶抗酶解能力明显提高,且随着EDC浓度的升高而增强。

3.4 电镜扫描结果显示,EDC交联的纤维蛋白凝胶较对照组有着更紧密有序的三维空间结构,平均孔径逐渐缩小,交联密度随着EDC浓度的增加而加强。EDC在提高纤维蛋白凝胶稳定性的同时又保留了支架的三维多孔空间结构。

3.5 本研究中所用的LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit的作用原理基于目前公认的2个衡量细胞生存活力的指标,包括细胞内酯酶活性和细胞膜的完整性,这是目前国际上公认的检测细胞活力快速、有效的方法。用该试剂盒检测凝胶块中细胞的生存活力具有敏感、准确的特点。

3.6 EDC交联过程中不进入凝胶基质,而是生成水溶性的脲衍生物,无细胞毒性。实验过程中,实验组(2)(纤维蛋白原200 mg◦mL-1+EDC 200 mg◦mL-1)样本内的细胞在培养1周时大部分死亡,实验组(3)(纤维蛋白原200 mg◦mL-1+EDC 300 mg◦mL-1)样本内的细胞在培养第4天时全部死亡。可能有2种原因：(1)这2种支架材料空间结构太紧密,不能为细胞的生长提供足够的空间,限制了培养液中营养物质的流通,阻碍了细胞的生长,最终导致细胞死亡。(2)由于反应成胶的时间较长,反应过程中高浓度的EDC有一定的细胞毒性,影响细胞活力导致死亡。因此该2种实验配比不适用于构建组织工程软骨。

3.7 本研究结果表明,在实验观察期间,软骨细胞在对照组(纤维蛋白原200 mg◦mL-1+凝血酶100 U◦mL-1)和实验组(1)(纤维蛋白原200 mg◦mL-1+EDC 100 mg◦mL-1)的支架材料中存活良好,在第10天仍保持较好的活力。而对照组在第7天开始出现降解现象,发生细胞从凝胶块中脱离现象。而实验组(1)在培养的第10天凝胶块的形态和强度仍无明显变化,说明该支架材料不仅能为细胞的生存提供足够的条件,而且有更强的抗降解能力,具备构建组织工程软骨的可能性。但是该实验配比制备的纤维蛋白凝胶对软骨细胞的增殖分化、细胞外基质的分泌沉积有无影响,以及是否能够在大型动物体内成功构建组织工程软骨尚需要进一步研究。

总之,适当浓度EDC交联的纤维蛋白凝胶在生物强度和抗酶解能力方面较传统的纤维蛋白凝胶有明显提高,所形成的多孔隙网状结构能为细胞的生长提供足够的空间,软骨细胞在该支架材料内存活良好。但是过高浓度的EDC交联形成的支架则限制了细胞的生长。

1 Vacanti CA,Langer R,Schloo B,et al.Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation[J].Plast Reconstr Surg,1991,88(5)：753.

2 Taguchi T,Saito H,Iwasashi M,et al.Development of a novel glue consisting naturally-derived biomolecules：citric acid and human serum albumin[J].J Nanosci Nanotechnol,2007,7(3)：742-747.

3 Park SN,Lee HJ,Lee K H,et al.Biological characterization of EDC-crosslinked collagen-hyaluronic acid matrix in dermal tissue restoration[J].Biomaterials,2003,24(9)：1631-1641.

4 Rafat M,Li F,Fagerholm P,et al.PEG-stabilized carbodiimide crosslinked collagen-chitosan hydrogels for corneal tissue engineering[J].Biomaterials,2008,29(29)：3960-3972.