凌 娜,季宇彬,于 蕾,邹 翔

(1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心哈尔滨 150076;2.抗肿瘤天然药物教育部工程研究中心,哈尔滨 150076)

野西瓜(Capparis spinosa,CS)为白花菜科山 柑仔属植物,又称老鼠瓜、刺山柑、瓜儿菜、槌果藤,维语称“波里克果”或“卡盘”,是荒漠、半荒漠、干旱、半干旱地区极有栽培价值的抗旱植物[1].主要分布于欧洲、北美、大洋洲、亚洲西部,我国新疆、甘肃、内蒙古、西藏等省区.野西瓜的药用部位为叶、果和根皮.在新疆省内广泛用于治疗风湿性关节炎、疮毒、肩周炎、皮炎和疟疾等疾病[2-4].国内有多位学者研究了野西瓜中的挥发油成分[5-7],但对野西瓜挥发油诱导肿瘤细胞凋亡的机制报道较少.本研究通过 MTT、SRB及 Annexin V/PI双染体外试验来观察野西瓜挥发油对人肝癌 HepG-2细胞的生长抑制作用,并探讨其作用机制.

1 实验材料

1.1 药品及试剂

野西瓜挥发油由哈尔滨商业大学药物研究所提供.RPMI-1640干粉(美国 GIBCO公司)、胎牛血清(杭州四季青),胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶 (PI)、MTT、磺酰罗丹明 B(Sulforhodamine B,SRB)均为 Sigma公司产品,Annexin V细胞凋亡试剂盒(美国 Biovison公司),阿霉素(浙江海正药业股份有限公司).

1.2 肿瘤细胞系

人肝癌细胞株HepG-2,由哈尔滨商业大学药物研究所提供,于 RPMI 1640培养液中加入 10%的胎牛血清,青霉素 100 u/m L,链霉素 100 mg/L,置 37℃、5%CO2孵箱中培养,3～4 d传代 1次.

1.3 仪器和设备

CO2培养箱(美国 NBS公司),酶标仪(美国Bio-Rad公司),倒置显微镜(日本 OLYMPUS公司),流式细胞仪 (美国 BECKMAN-COULTER公司,EPICSXL),超净工作台(苏州净化设备厂),电子分析天平(Sartorius),TDL80-2B低速离心机(上海安亭科学仪器厂).

2 实验方法

2.1 MTT法检测野西瓜挥发油对 HepG-2细胞的抑制作用

取处于对数生长期的 HepG-2细胞,消化后悬浮在一定量的培养液中,计数后调整细胞浓度为1×104个/m L,接种于 96孔板,每孔 100μL,置 37℃,CO2体积分数为 5%的饱和湿度条件下培养.待 24 h细胞完全贴壁后,试验组加入挥发油至终质量浓度为 10、50、100、150、200 μg/mL;阳性对照组阿霉素的质量浓度为 0.01、0.1、1、10μg/m L;空白对照组加相同体积的培养液,每个剂量设 6个平行样,继续培养 72 h后,弃去上清液后,每孔加入MTT染液 100μL(0.5 mg/m L),继续培养 4 h,弃上清每孔加入 DMSO 200μL震荡 5～10m in后,使用酶标仪检测 570 nm处吸光度,并按中效方程计算IC50

抑制率(%)=(1-试验孔平均 OD值 /对照孔平均 OD值)×100%

2.2 SRB法检测野西瓜挥发油对 HepG-2细胞的抑制作用

将对数生长期的 HepG-2细胞用胰酶消化后调成浓度为 3×104/m L的细胞液,每孔 100μL接种于 96孔板.培养 24 h后加入野西瓜挥发油至终浓度为 10、50、100、150、200和 300 μg/mL,阳性对照组阿霉素的质量浓度为 0.01、0.1、1、10μg/m L空白对照组加相同体积的培养液,每个剂量设 6个平行样,同时测定此时细胞的 OD515值(T0).72后弃上清,加 50%的冷三氯乙酸(TCA)液,置 4℃冰箱中固定 1 h,倒掉固定液,用去离子水洗 5遍,干燥后加 4mg/mL SRB染液,室温放置 30min;倒掉染液用 1%醋酸洗 5遍,过夜干燥,加浓度为 10 mmol/L的 Tris缓冲液 150μL,10 min后测定 OD值,波长为 515 nm.用如下公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率,并按中效方程计算 IC50.计算细胞50%生长抑制所需的药物质量浓度(GI50);细胞完全生长抑制所需的质量浓度(TGI);杀死 50%细胞所需的药物质量浓度(LC50)[8].

公式:生长率%=[(T-T0)/(C-T0)]×100%细胞杀死率%=[(T-T0)/T0]×100%

其中:GI50为[(T-T0)/(C-T0)]=50%时的药物浓度;TGI为 T=T0时的药物质量浓度;LC50为[(T-T0)/T0]=-50%时的药物质量浓度;C表示对照组细胞的 OD值;T表示加药组细胞的OD值;T0表示加药时对照平板细胞的 OD值.

2.3 Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞早期凋亡

将对数生长期的 HepG-2细胞,用胰酶消化后调成浓度为 3×105/mL的细胞液,每孔 1mL接种于 6孔板中.培养 24 h后加入野西瓜挥发油至终质量浓度为 75、150和 300μg/m L,阳性对照组阿霉素质量浓度为 5μg/m L;空白对照组加相同体积的培养液.24 h后收集细胞,冷 PBS洗细胞 2次,细胞数(1～5)×105个/m L.将细胞重悬于 500 μL的 1×Binding Buffer,然后加入 5μL Annexin V-FITC和 10μL PI染色液,室温避光孵育 5 min离心去上清,PBS洗 1次,最后将细胞重悬于 1 m PBS,用流式细胞仪分析,激发光波长用 488 nm,用波长为 515 nm的通带滤器检测 FITC荧光,另一波长大于 560 nm的滤器检测 PI.

2.4 实验数据处理

应用 SPSS11.5软件对数据进行统计学处理,结果以±S表示,组间比较采用方差检验.

3 实验结果

3.1 MTT法检测野西瓜挥发油对 HepG-2的细胞毒作用

MTT结果显示,野西瓜挥发油对 HepG-2细胞生长有抑制作用,并呈剂量依赖性,药物的质量浓度 -抑制率曲线呈 S形,符合 Logistic曲线.根据生长抑制率采用综合法计算半数抑制量 IC50,MTT结果显示野西瓜挥发油对 HepG-2细胞的 IC50值为 127.5μg/mL.

3.2 SRB法检测野西瓜挥发油对 HepG-2肿瘤细胞增殖的影响

SRB是一种蛋白质结合染料,粉红色,可溶于水.此实验方法的原理是 SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合,在 515 nm的 OD读数与细胞数呈良好的线性关系,故可用作细胞数的定量.用该方法观察了野西瓜挥发油对体外培养的 HepG-2细胞增殖的影响,结果如表1.

表1 野西瓜挥发油对HepG-2细胞增殖的影响(SRB)

3.3 Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞早期凋亡

应用 Annexin V联合 PI双染色,流式细胞仪检测分析,正常活细胞 Annexin V和 PI均为低染;细胞凋亡早期的细胞膜完整,Annexin V高染,细胞膜呈绿色荧光,PI低染,细胞核不着色;凋亡中、晚期细胞则 Annexin V和 PI均高染,细胞膜呈绿色荧光,细胞核呈红色荧光.获取的数据用 Annexin V-FITC荧光强度 (FL1)为 X轴,PI荧光强度(FL2)为 Y轴的散点图分析.用十字标记(Maker)将图像分为 4个象限,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右下象限为早期凋亡细胞,显现(FITC+/PI-);左上象限为坏死细胞,为(FITC+/PI+);右上象限为晚期凋亡细胞,为(FITC+/PI+).

实验结果可见,75μg/mL和 150μg/mL的野西瓜挥发油作用于 HepG-2细胞 24 h后,活细胞数为 93.4%～93.2%,早期凋亡细胞为 5.3%～5 5%;300μg/mL的野西瓜挥发油作用于 HepG-2细胞 24 h后活细胞数量减少到 84.3%,早期凋亡细胞增至 13.7%.5μg/mL的阿霉素组 HepG-2细胞中活细胞数仅为 3.8%,晚期凋亡及坏死细胞分别为 52.9%和 42.1%(图1).

4 讨 论

细胞凋亡(Apoptosis)是指在生理或病理状态下,细胞启动自身基因调控机制而发生的有序的、主动的自然死亡过程,是正常细胞维持群体数量稳定,清除转化细胞,防止癌变所必需的生命活动之一.它的异常与许多疾病尤其是肿瘤的发生发展有关.

细胞凋亡的早期事件之一是:细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidyl serine,PS)从细胞膜内转移到细胞膜外.目前应用 Annexin V联合 PI双染色法是检测细胞凋亡较为理想的方法之一[9]PS位于正常细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中,Annexin V是一种分子质量为 35～36 ku的钙依赖性磷脂结合蛋白,能与 PS高亲和力特异性结合,它可以作为探针检测暴露在细胞膜表面的 PS.碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)是一种核酸染料,不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中、晚期的细胞和死细胞中,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染.将 Annexin V标记上异硫氰酸荧光素(FITC),同时结合使用 PI拒染法进行凋亡细胞双染后利用荧光显微镜检测细胞凋亡[10].该方法可将凋亡早、中、晚期的细胞以及死细胞区分开来:正常活细胞 Annexin V和 PI均低染,不着色;凋亡细胞的早期,Annexin V高染,细胞膜呈绿色荧光,P低染,细胞核不着色;凋亡中、晚期细胞则 Annexi V和 PI均高染,细胞膜呈绿色荧光,细胞核呈红色荧光.获取的数据用 Annexin V-FITC荧光强度(FL1)为 X轴,PI荧光强度(FL2)为 Y轴的散点图分析.用十字标记(Maker)将图像分为 4个象限,一般把 Annexin V-FITC染色阴性/PI染色阴性的活细胞划在左下象限中,把 Annexin V-FITC染色阳性/PI染色阴性的凋亡细胞划在右下象限中,左上象限中是 Annexin V-FITC染色阳性/PI染色阳性的死亡细胞.左上象限中多无细胞,但当样品为机械分散的实体组织细胞或细胞诱导处理作用过强时间过长时,可有不等数量的细胞出现在该象限中,其中可能包括细胞膜已丢失的裸核细胞(核结构完整)[11].与传统方法比较,Annexin V联合 PI双染色法检测凋亡细胞不需要固定,灵敏性、特异性高,结果更为可靠.其最大特点是检测细胞膜尚未破裂的早期凋亡细胞,并可区别不同的细胞群体,以观察这些细胞群中有无细胞凋亡过程.

图1 不同质量浓度的野西瓜挥发油对HepG-2细胞形态的影响

以野西瓜挥发油作用于 HepG-2细胞,通过MTT法验证野西瓜挥发油对 HepG-2细胞的生长有抑制作用,且具有剂量依赖关系,72 h的 IC50为127.5μg/m L.SRB结果显示低质量浓度的野西瓜挥发油通过抑制肿瘤细胞生长而起抗癌作用,其GI50约为 131.98μg/m L,当质量浓度达到 301.91 μg/m L时细胞生长受到完全抑制,随着浓度继续增加至 168.24μg/mL时有一半数量的细胞被杀死.采用 Annexin V/PI双染色法,流式细胞仪检测到 HepG-2细胞凋亡的情况.随着野西瓜挥发油剂量的增加,凋亡细胞数呈上升趋势.研究还发现野西瓜挥发油可使 HepG-2细胞发生 Gl期阻滞,阻断细胞周期进入 S期,导致线粒体膜电位的降低和钙超载[12-13].进一步说明了野西瓜挥发油通过启动线粒体途径诱导 HepG-2细胞凋亡,进而抑制 HepG-2细胞的生长.

[1] 张立运,杨 春.保护风蚀地的刺山柑[J].植物杂志,2004,1:3-4.

[2] 罗 俊,谢 阳.维药刺山柑果治疗痛风风湿病 15例[J].中国民族医药杂志,1999,5(2):3.

[3] 任解莉.老鼠瓜单味外用治疗肩周炎 121例[J].新疆中医药,2002,20(4):13.

[4] 单文俊,丁玉庆,谢举锋.外用野西瓜致接触性皮炎 1例[J].实用医学杂志,2005,2l(9):982.

[5] 白宏进,赵小亮,刘文杰.刺山柑果实挥发油化学成分的研究[J].安徽农业科学,2007,35(9):2517-2518.

[6] 谢丽琼,马东建,薛淑嫒.维药刺山柑果实挥发油和脂肪酸成分的 GC-MS研究[J].食品科学,2007,28(5):262-264.

[7] 赵小亮,白红进.刺山柑果柄挥发油化学成分的 GC-MS分析[J].食品研究与开发,2007,28(7):115-118.

[8] SUN L Y,SHAO S H.Effects of Na2SeO3Detected by SRB Method on the Growth ofHepG-2 Cells[J].JBeihua University:Natural Science,2004,5(2):122-123.

[9] SGONC R,GRUBER J.Apoptosis detection:an overview[J]Experimental Gerontology,1998,33(6):525-533.

[10] 谭晓华,张亚历,周殿元,等.细胞凋亡的方法学研究进展[J].肿瘤,1997,17(5):288-291.

[11] 李 欣,路 菊.用 Annexin V流式细胞术检测细胞凋亡的体会[J].检验医学,2005,20(6):598-599.

[12] 季宇彬,于 蕾,王 崴,等.野西瓜挥发油对 HepG-2细胞线粒体膜电位和 Ca2+浓度的影响[J].中国天然药物,2008,6(6):474-478.

[13] 庞琳琳,于 蕾,杨海帆,等 .野西瓜水溶性生物碱抑制HepG-2增殖作用[J].哈尔滨商业大学学报:自然科学版,2009.25(14):391-394