翁海波，王志强，敬蔚然

（郑州大学生物工程系，河南 郑州 450001）

能源是人类社会赖以生存和发展的重要物质基础。随着世界人口的增加以及各国工业化水平的提升，整个社会对能源的需求量与日俱增。应用生物能源转化技术可将生物质转变为清洁能源，能缓解石油、天然气等不可再生化石能源日渐枯竭带来的能源压力。目前生物转化使用的原料是玉米等粮食作物，但是这些原料的大量使用会影响到粮食安全，所以秸秆、麸皮、锯木粉等农业、工业废弃物等含有大量的木质纤维素，将是很有潜力的乙醇发酵原料。另外，生物燃料的生产过程中，纤维素的预处理和纤维素酶的生产成本较高[1-2]。因此减少预处理，增强纤维素酶的活性，提高发酵产物的产量和纯度，减少中间环节也是降低生产成本的途径。

联合生物加工（consolidated bioprocessing，CBP）不包括纤维素酶的生产和分离过程，而是把糖化和发酵结合到由微生物介导的一个反应体系中，因此与其他工艺过程相比较，底物和原料的消耗相对较低，一体化程度较高[3]。本文主要讨论CBP的概念，可行性和策略，以及真菌的应用和发展前景。

1 CBP的可行性和必要性

应用联合生物加工是可行的。有关热纤梭菌利用纤维素的研究为CBP可行性提供了实验证据。生理学研究和14C标记的纤维素实验说明，生长于纤维素上的微生物的生物能量效益取决于胞内低聚糖摄取过程中β-糖苷键磷酸解的效率，并且这些效益超过了纤维素合成的生物能量成本[3-4]。这些研究为纤维素分解菌在纤维素上快速生长提供了实验依据和理论依据。

以酶-微生物复合体存在比纤维素酶复合体单独存在时纤维素酶的作用效率要高。在厌氧菌中，酶-微生物复合体的协同作用在降解纤维素时处于中心地位。然而，以产纤维素酶为特征的工业生产中却不添加活体纤维素裂解菌。应用以酶-微生物复合体为作用特征的CBP工艺将是必要的，是未来的研究方向。

2 CBP的策略

应用联合生物加工的关键是构建出能完成多个生化反应过程的酶系统，使纤维素原料通过一个工艺环节就转变为能源产品。一些细菌和真菌具有CBP所需要的特性，所以改造现有的微生物已成为研究的热点。以基因重组等为代表的生物工程技术已经使这种设想成为现实，并为设计出更完善的CBP酶系统提供了可能。对相关的微生物改造主要有以下3个策略。

2.1 天然策略

天然策略是将本身可产生纤维素酶的微生物，尤其是厌氧微生物进行改造，使其适应CBP生产的要求。这种策略关键在于，提高对乙醇的耐受力，减少副产物的生成，导入新的代谢基因将糖化产物全部或者大部分进行发酵，从而产出高浓度的乙醇。有研究者对耐乙醇嗜热菌株的进行了筛选和改造[5]，所得的菌株能在60 g/L的乙醇浓度下生长，乙醇耐受性能满足CBP工艺的要求。另外，对嗜热菌和大肠杆菌来说，副产物如有机酸及其盐抑制作用更强，缺少有机酸将会使乙醇的浓度显著升高[6]。如敲除热解糖梭菌的有机酸合成基因，结果未检测到无机酸，而检测到较高产量的乙醇[7]。另外通过电转化的方法，在解纤维梭菌和热纤维梭菌中，实现了异源纤维素酶基因转移和表达。

2.2 重组策略

重组策略是通过基因重组的方法表达一系列的外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶等纤维素酶基因，使微生物能以纤维素为唯一碳源，将来源于纤维素的糖类完全或者大部分进行发酵。这方面的微生物有大肠杆菌，毕赤酵母，酿酒酵母等[8-9]。重组策略方面的研究取得了一定的成果。不同菌株所编码糖苷水解酶（如纤维素酶，半纤维素酶，β-D-半乳糖苷酶），木聚糖降解酶，阿拉伯糖降解酶的基因已经被导入酿酒酵母。能在纤维素，半纤维素，纤维二糖，木聚糖，阿拉伯糖上生长的工程菌也有报道。

重组策略所遇到的问题有：（1）外源基因共表达对细胞的有害性。如在酿酒酵母中导入大量的外源基因可能导致基因表达不稳定和对细胞表面产生其他不利影响。（2）需要在转录水平使外源基因适量表达。如在酿酒酵母中，里氏木酶的纤维二糖水解酶Ⅰ基因需要高水平表达以保证所需要的酶活性，但其他的一些外源基因不需要太高的表达。这需要研究如何利用酵母的调控蛋白，找到合适不同基因的启动子和转录调控元件，准确的调节不同基因的表达量。（3）一些分泌蛋白可能折叠不正确。纤维素降解蛋白合成之后必须要正确折叠才能分泌并行使功能。未正确折叠的蛋白分泌后要通过内质网结合蛋白降解，而且对内质网造成压力[10]。需要更进一步的了解酵母内质网降解机制和非折叠蛋白反应机制，以使所有的纤维素降解酶都能穿过内质网，正确地折叠，行使相应的功能。

2.3 共培养策略

纤维素糖化液含有葡萄糖，麦芽糖，乳糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖等多种糖分，利用共培养法能提高发酵效率。共培养策略有两层含义：一是指发酵液中存在的不同的类型的微生物，利用广泛类型的糖类底物。例如将仅能利用己糖的热纤维梭菌与能利用戊糖的微生物进行共培养。这能避免不同生物间的底物竞争，实现乙醇产量最大化。二是指存在不同特性的微生物相互协作，加强发酵效果。如Kohji Miyazaki等将好氧菌和厌氧菌共发酵，提供了发酵过程中的协同模型[11]。Shrestha等用白腐菌在37℃下，对玉米纤维进行1～3 d的预处理，发现用酿酒酵母和白腐菌共培养发酵玉米纤维会产生更多的乙醇，每100 g玉米纤维产3 g乙醇[12]。建立稳定的共培养体系是个复杂的过程，要考虑培养基，生长条件，以及菌株间的代谢关系。稳定结构的细菌群体的标准是各种生物的生物量在传代后不会有大的变化并且能够至少传代20次。

3 里氏木霉在CBP上的应用研究

3.1 里氏木霉的特点

里氏木霉有两个生物合成体系：一种是在有氧条件下产纤维素酶系统，另一种是厌氧条件下产乙醇的酶系统。它有多种优点。（1）相对于其他的微生物，里氏木霉能产生更足量的酶。研究表明，以可溶性糖（葡萄糖和木聚糖）为底物，里氏木霉的乙醇产量低于其他真菌，但以纤维素为底物比其他的丝状真菌的乙醇产量高[13]。这可能是由于里氏木霉有很强的分泌系统，并且能产生大量的纤维素降解酶。如细胞溶胶中的内质网和高尔基体能产生和分泌复杂结构的酶，如纤维二糖水解酶Ⅰ，而细菌没有这些分泌系统。（2）里氏木霉能在低成本的培养基上生长。（3）能利用木质纤维素糖化产生的所有的糖类产乙醇。（4）里氏木霉能产β-D-葡（萄）糖苷酶将纤维二糖转化为葡萄糖，解除代谢初产物纤维二糖对纤维素酶活性的抑制[14]。里氏木霉的这种基本特征决定着它在CBP中将有广泛的应用。

3.2 提高乙醇产量的策略

3.2.1 提高乙醇耐受力 耐受乙醇要通过以下策略优化：（1）乙醇耐受基因的鉴定和修饰。（2）导入其他基因。如酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶，乙醇脱氢酶来增强乙醇合成。（3）敲除副产物的相关基因。高浓度的乙醇能改变细胞膜上的受体蛋白，阻遏糖酵解和代谢循环，最终抑制细胞的生长和发酵。许多证据表明，乙醇耐受基因不是单一的基因，全转录工程提供了一个新方法。例如分别通过三种转录调控因子基因的突变，酿酒酵母的乙醇耐受力有所提高[15]。

3.2.2 提高糖转运效率 糖类不能自由地穿过细胞膜，微生物是通过特定的糖转运蛋白来利用糖类，所以了解糖转运机制是必要的。转运蛋白作为培养基中糖浓度的“感受器”，可产生相应的胞内信号.不同的糖转运蛋白在不同的浓度下行使功能，从而使微生物在较广的范围内利用糖类。已有里氏木霉的糖转运蛋白的研究报道[16]，对转运蛋白的深入研究，可以使转运蛋白在低糖浓度下对糖类的亲和力较高，使糖类更好的被利用。可以有目的地提高转运蛋白的数量，可以表达多种糖类的转运蛋白，以尽可能多的利用生物质产生的糖类。

4 研究展望

随着化石能源的减少，寻求清洁能源将是未来的普遍做法。利用乙醇作为清洁燃料将会带来经济效益和环境效益。目前我国的乙醇主要由甘蔗、玉米等粮食生产，因此受到原料价格和来源上的限制。CBP具有明显降低乙醇生产成本的潜力，越来越多的文献也证明了其可行性，为低成本生产乙醇提供了有效的工艺。纤维素降解菌里氏木霉能够分泌一系列酶将木质纤维素分解为糖，并能最终发酵为乙醇。在这方面的研究必将使低成本的生物质能源转化技术实现跨越式的发展，并带来可观的社会效益。

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