朱国坡,周晓丽,郭延锋,李瑞芳,高均伟,陈仕均,王丽荣,4,刘兴友,4*

(1.河南科技学院,河南新乡453003;2.河南农业大学,河南郑州450002;3.石河子大学,新疆石河子832003;4.动物疫病和残留物防控河南省高校工程技术研究中心,河南新乡453003)

原代细胞培养因具有细胞刚刚离体,生物性状尚未发生很大变化,具备二倍体的遗传性、来源方便等优点而广泛应用于病毒学、细胞分化、药物测试等试验中。在禽类原代细胞培养中,鸡胚成纤维细胞(chicken embryofibrob last,CEF)得到普遍应用。CEF的培养是在一定的条件下,在体外模拟体内生理环境,使从体内取出的成纤维组织细胞生存、生长和传代,并维持原有组织细胞的结构和功能特性。早年的组织培养工作者,如Carrel等曾用鸡胚做过大量研究工作[1]。与其他细胞相比,CEF相对容易获得,而且增殖能力强,适应性强,具有良好的耐受性,性状比较稳定,不易发生转化[2]。正是具备以上的特点,使得其被广泛地应用于分子和细胞生物学的研究的许多方面。

1 鸡胚成纤维细胞的制备

1.1 取材

CEF细胞的制备一般选用9日龄～11日龄的SPF鸡胚,鸡胚日龄不宜过大,否则剪碎组织时候较为困难,而且杂细胞也会较多。可参考的方法是,分别用碘酒和酒精棉由鸡胚中央向四周擦拭消毒,然后放入超净台,将有气室的部位朝上,小心地用无菌镊子磕破蛋壳,沿气室边缘夹掉蛋壳,注意不让蛋壳碎屑落入蛋内,换用新的无菌镊子揭开尿囊绒毛膜,再用弯头镊子深入胚内夹住鸡胚颈部取出,放入平皿中,将取出的鸡胚去头、四肢、内脏,放入一小烧杯中,然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎,直到成1 mm3左右的小块,再用HBSS清洗3遍,至组织块发白为止[3-6]。

1.2 分离

在培养液中1 mm3的鸡胚成纤维细胞组织块,仅有少量处于周边的细胞可能生存和生长。若要获得大量生长良好的成纤维细胞,须将组织分散开,使细胞解离出来。目前,分离CEF的方法主要是以胰蛋白酶和胶原酶的酶消化法为主。胰蛋白酶适用于消化细胞间质较少的软组织(如胚胎、上皮、肝、肾等组织),其消化效果主要与pH、温度、胰蛋白酶的浓度、组织块的大小和硬度有关,钙、镁离子和血清均对该酶有抑制作用。胶原酶适用于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等,在钙、镁离子和血清存在的情况下仍具有活性,因此使用该酶消化后需要清洗细胞。相对于胰蛋白酶,胶原酶的价格昂贵,增加了试验成本,所以研究中胰蛋白酶应用最为广泛。可参考的分离方法是,将剪碎的组织块移入广口瓶中,加入适量的2.5mg/mL胰酶,于37℃水浴中消化30min左右,每隔5 min振荡1次,使细胞消化均匀。当组织块变得蓬松透明时,吸弃消化液,用HBSS洗2遍,终止消化。应严格控制消化时间,及时终止消化作用,以免过量消化对细胞的损伤。研究中应结合具体情况而定,如吕利奇等[7]结合胰酶连续消化法与玻璃珠分散法制备CEF细胞,并且认为该方法是制备CEF细胞的最佳方法。

1.3 纯化

机体内的细胞都混杂生长,因而从体内取得的培养材料所做的原代培养,绝大多数都呈混合生长,主要表现为两大类,即上皮样细胞和成纤维样细胞。纯化方法分为人工纯化和自然纯化,人工纯化包括酶消化法、机械划除法、反复贴壁法、克隆法、流式细胞仪分离法等。应视具体情况,选择合适的纯化成纤维细胞的时机和方法。当成纤维细胞比例较大,上皮样细胞生长缓慢、较少时,就不需要做清除处理,通常传代之后可逐渐自然清除上皮样细胞。成纤维细胞与上皮样细胞生长都比较旺盛、且比例相当时,应尽量等培养物长成单层后处理。这样成纤维细胞数目较多,去除上皮样细胞的成功率较高。

研究中多联合运用酶消化法和反复贴壁法来达到纯化成纤维细胞的目的。由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶耐受性不同,在消化培养细胞时,常常是成纤维细胞先脱壁,而且传代后贴壁快,附着快,而上皮细胞在短时间内不能附着或附着不稳定,稍振动即浮起,需要生长基质如胶原或其他细胞外基质成分等的支持,在原代培养早期此差别尤为明显,因此,利用这个差别,经酶消化法和反复贴壁法处理2代～3代后,能够完全纯化成纤维细胞[8]。可参考方法如下:将2.5mg/mL胰蛋白酶注入培养瓶2次,稍加摇动,让胰蛋白酶流过所有细胞,吸出消化液,将培养瓶放在倒置显微镜下观察,发现纤维样细胞变圆,部分脱壁,立即加入有血清的培养液终止消化,用弯头吸管轻轻吹打纤维样细胞生长区域,将培养瓶中的液体吸出分装于准备好的培养瓶中,放入CO2培养箱中培养。

2 鸡胚成纤维细胞的培养

CEF的培养相对较为容易。首先是培养器皿的选择,由于CEF贴壁性较好,其对培养器皿的选择没有严格的要求,目前大多数研究者选用塑料、玻璃培养皿或培养瓶。为了增加贴壁细胞的表面积,张立等[9]认为胶原型微载体(如GT-2、Cytodex-3)是CEF最适合的微载体。其次是培养基和培养介质的选择,用于CEF的常用培养液有乳汉液、199培养液及DM EM培养液等。多数研究者一般使用含有血清的DMEM培养基。血清中的生长因子对于成纤维细胞有较强的促有丝分裂作用,并可通过诱导终末分化抑制上皮细胞的增殖。研究中添加的血清达到100 mL/L以上,对于有效抑制上皮细胞的增殖具有重要作用[10]。另外,不同来源的血清,在培养时虽然质量分级一样,但细胞生长情况也会有显著差异,因此在研究同一细胞时尽量使用同一批次的相同等级血清。再者是培养条件的选择,动物细胞一般适宜的pH范围为7.2～7.4,当pH偏低或偏高时均会影响细胞的正常生长,而向培养基中加入NaHCO3或HEPEs能有效起到平衡的pH的作用。研究中大多数人用37℃,体积分数为5%的CO2培养箱中培养CEF细胞,但也有用38.5℃或39℃的培养温度。

3 鸡胚成纤维细胞的应用

CEF细胞良好的耐受性使之易于进行从基因转染到微注射等较多领域的研究,还被广泛应用于病毒学领域的相关研究,同时也是疫苗生产的一种重要的细胞资源。现在它被用来生产各种鸡的疫苗,如传染性法氏囊病、马立克病、新城疫疫苗等,也被用来表达一些基因工程产物。CEF的原代培养在分子生物学、细胞学、遗传学、免疫学、肿瘤学及细胞工程学等领域,已发展成为一门重要的生物技术,并取得显著成就。

CEF之所以能够增殖病毒是因为细胞上有病毒受体。然而Brandt M等[11]研究表明,IBDV超强毒株无CEF细胞受体,在其传代致弱过程中,VP2基因的几处核苷酸改变导致其细胞嗜性的改变,然而致弱毒株与CEF如何作用及病毒的CEF受体还未见相关报道。CEF细胞cDNA文库的成功构建为筛选和研究CEF上病毒受体分子奠定了基础,同时也为研究其他适应于CEF上生长的病毒提供可靠的试验基础,而且文库也可用于CEF相关功能蛋白的研究[12-15]。在分子生物学领域,陈学辉等[16]用RNA干扰(RNAi)试验成功阻断了CEF的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)的表达,傅安静等[17]用脂质体转染试剂转染化学合成的GFP-siRNA,成功地干涉了腺病毒载体介导的GFP基因在CEF的表达,这为利用RNAi技术,通过阻断基因表达而研究病毒和鸡的基因功能奠定了基础;姜世金等[18]利用CEF细胞来表达马立克病病毒(MDV)的pp38基因;Ravindra P V等[19]利用CEF接种新城疫病毒(NDV)后,通过检测发现NDV的HN蛋白引起了CEF的细胞凋亡。另外,高喜梅等[20]利用CEF接种MDV后,用微卫星标记技术对CEF的部分染色体上微卫星不稳定性进行了研究;Sharma A等[21]的研究结果表明,CEF也可用于细胞毒性的检测。万学琴等[22]采用低血清法培养CEF至单层后,以人白蛋白代替小牛血清培养的NDV的效价和活性符合人用疫苗要求。总之,随着CEF培养方法和技术的成熟,其也将会被应用于更广更深的研究领域。

4 展望

综上所述,鸡CEF是一类较易获得的细胞,随着培养原理与方法的日臻完善,其大规模培养技术趋于成熟,以及相应细胞系的建立[23-25],将极大降低在诸多领域的研究困难,将会为研究一些动物和人类疾病发挥着重要作用。研究表明,CEF的细胞受体和细胞嗜性决定病毒是否可以增殖。因此,病毒与CEF如何作用及病毒的CEF受体也成为未来的研究方向。

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