陈蓓莉，王晓桃，林文远，刘 健，莫东华

(桂林医学院附属医院血液内科，广西 541001)

α-干扰素(interferon-α，IFN-α)能够抑制肿瘤细胞的生长，增加NK细胞以及其他免疫活性细胞的功能，具有广谱的抗肿瘤活性，目前已被广泛应用于血液系统肿瘤的治疗[1]。Toll样受体(Toll-like receptors，T LRs)是一类介导天然免疫反应并桥接或触发适应性免疫模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)[2]。熊芳等[3]首次在国内报道 TLR1～9都在U 937细胞表达，而内毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)作为Toll样受体的主要外源性配体，LPS须与其受体 TLR4结合后通过信号转导的级联反应方能产生效应[4]。因此，α-干扰素与LPS联合能否增强U 937细胞的凋亡需要进一步研究。Manfred等[4]报道α-干扰素联合 Toll样受体激动剂如 LPS可增强外周血单核细胞的凋亡;Huang等[5]报道通过激活TLR信号转导途径可增强多种肿瘤细胞的凋亡。而α-干扰素联合LPS能否增强白血病细胞的凋亡国内未见报道。本研究旨在体外研究α-干扰素联合脂多糖对白血病细胞增殖及凋亡有无协同作用，为TLR配体作为佐剂的使用及协同α-干扰素在免疫治疗白血病中开拓出一条新的思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人急性髓系白血病(AML)细胞株U937、HL60购自上海细胞所。

1.2 实验材料与仪器 淋巴细胞分离液(上海试剂二厂);24孔、96孔培养板(美国 Corning公司);RPMI-Medium1640干粉、胎牛血清(FBS，天津血液病研究所);四甲基偶氮唑蓝(M TT)、DMSO溶液(北京 SABC公司产品);AnnexinV/PI(碘化丙锭)试剂盒(德国Bender公司);RT-PCR试剂盒(南京博泰生物技术有限公司);引物合成(北京赛百盛生物公司);Trizol试剂(美国Invitrogen公司);各种引物序列(上海博亚生物技术有限公司);自动酶标读数仪(国产DG-3022);Fluor Chem TM 8900凝胶成像系统(美国Alpha Innotech公司);流式细胞仪(美国 BD公司)等。

1.3 研究方法

1.3.1 细胞传代培养 急性髓系白血病细胞株U 937、HL 60从外室引进后，常规离心弃上清液，复苏后的细胞在含体积分数10%的加热灭活的胎牛血清(10%FBS)及100Μ/m L青霉素、100μg/m L链霉素的 RPMI1640培养基中，置于37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO2孵箱中培养，每3天更换培养基并传代1次。本实验用的细胞均处于对数生长期。

1.3.2 MT T法检测α-干扰素联合脂多糖抑制白血病细胞增殖的作用 根据处理细胞药物的不同将实验组分为单用1000 u/m Lα-干扰素组、单用100 ng/m L脂多糖组，按上述剂量 1∶1组成α-干扰素联合脂多糖组共3组;对照组则为不加任何药物处理细胞组。将实验组中的U 937、HL60细胞株 0.1 m L加入96孔平底培养板中，使细胞浓度为5×105/mL，每组重复8孔，对照组加入等体积培养液，每孔最终体积为200μL。给药后置37℃含5%CO2的培养箱中培养，每3天更换1次培养液。在终止培养前4 h每孔加入20μL浓度为5 mg/mL的MTT，继续培养4 h后，2000 r/min离心10 min，弃上清液，每孔加150μL DMSO终止培养，使结晶溶解。置酶联免疫检测仪下测吸光度内值，计算其细胞生长抑制率(%)=(l-A处理组/A对照组)×100%，如为对照组，则以第 1孔为参照值，其余孔与其对照即可。

1.3.3 Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测α-干扰素联合脂多糖对白血病细胞凋亡的影响 实验分组同上，将人U 937、HL60细胞株0.1 m L置于10%FCS培养基中培养过夜，调节细胞密度至 5×106/m L，按实验分组再在含 10%FBS的RPM I1640的培养基中共同培育24 h后，收集细胞约5×105个，用 Binding Buffer洗 1次 ，100μL Binding Bμffer重悬，加5μL Annexin V-FITC，避光孵育 20 min，再加10μL PI(浓度为1 mg/m L)避光室温下孵育15 min，Binding Buffer洗涤、重悬，立即用FCM检测，每个样品至少检测1×105个细胞。对照组为不含任何药物的等体积培养液。利用Cell Quest功能软件进行参数获取和数据分析。每组样品重复3次，取均数。

1.3.4 流式细胞仪检测细胞周期 实验分组同上，将人U 937、HL60细胞株在无血清培养液培养24 h，使细胞生长周期同步化，调节细胞密度至1×106/m L，按实验分组再在含10%FBS的 RPMI1640的培养基中共同培育48 h后，600～800 r/min离心收集细胞，用PBS洗涤 2次，DNA-Prepstain染液染色，用FCM检测，每份样品约5000细胞，用 DNA Multi Cycle软件进行统计学拟合分析各组细胞周期时相。对照组为不含任何药物的等体积培养液。每组样品重复3次，取均数。

1.4 统计学处理 应用S PSS12.0统计软件进行数据分析，参数检验的计量资料以表示，多均数比较用单因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组对U937、HL 60细胞抑制率和凋亡率 不同药物与白血病细胞株U 937、HL60作用48 h后的抑制率和凋亡率见表1。从表1可知，实验组与对照组之间抑制率相比差异有统计学意义(F=204.67，P=0)。对照组中的AM L原代细胞凋亡率为(6.53±1.32)%，实验组与对照组之间凋亡率差异有统计学意义(F=42.11，P＜0.05)。事后经 LSD分析:实验组中各组的抑制率和凋亡率较对照组均明显提高(P=0);实验组中α-干扰素联合脂多糖组与α-干扰素、脂多糖组两组之间差异均有统计学意义(P=0)，而α-干扰素组与脂多糖组之间差异无统计学意义(P＞0.1)。

表1 各组U937、HL 60细胞的抑制率和凋亡率比较()

表1 各组U937、HL 60细胞的抑制率和凋亡率比较()

*:P=0，△:P ＜0.05，与对照组比较;#:P=0，与α-干扰素联合脂多糖组比较。

组别 抑制率 凋亡率对照组 0.07±0.03 0.08±0.04 α-干扰素组 0.37±0.05*# 0.31±0.04*△#脂多糖组 0.30±0.07*# 0.25±0.05△#α-干扰素联合脂多糖组 0.69±0.04* 0.51±0.13△

2.2 各组对 U937、HL60细胞周期的变化 各实验组中U 937、HL60细胞G1期比例增加、S期和G2期比例减少，而对照组中AML原代细胞S期比例偏高、G1期和G2期比例偏少，见表2。各实验组中G1期细胞与对照组之间差异有统计学意义。事后经LSD分析发现实验组中各组的凋亡率较对照组均明显提高(P＜0.05);实验组中α-干扰素联合脂多糖组与α-干扰素、脂多糖组两组差异均有统计学意义(P=0)，α-干扰素组与脂多糖组差异有统计学意义(P=0.03)。

表2 各组对 U 937、H L60细胞周期的改变(，%)

表2 各组对 U 937、H L60细胞周期的改变(，%)

*:P=0，与对照组比较。

组别 G1 S G2对照组 0.23±0.04 0.46±0.040.22±0.03 α-干扰素组 0.34±0.03*0.24±0.020.23±0.03脂多糖组 0.29±0.05*0.37±0.050.21±0.03 α-干扰素联合脂多糖组 0.49±0.05*0.21±0.030.22±0.01

3 讨 论

急性白血病的发生、发展是一个多基因、多步骤、多阶段的复杂过程。细胞凋亡异常对白血病耐药性的产生至关重要。因此，通过研究白血病凋亡机制、促进白血病细胞凋亡，可为白血病的治疗提供新的方法。

α-干扰素已经广泛用于恶性血液病的治疗并均有显著效果[6]。其治疗急性白血病的机制主要是通过调节宿主免疫学反应的活性作用或通过对肿瘤细胞增殖的直接抑制作用发挥抗白血病效应[7]。还可以通过调节凋亡调控因子的变化，如提高肿瘤坏死因子的活性、激活Caspase系统、调节白细胞介素活性及改变凋亡调控基因的表达等多种途径诱导白血病细胞凋亡[8-9]。本研究也证实了α-干扰素组较对照组而言，能显著地抑制白血病细胞株 U937、HL60的增殖，增加 G1期细胞的比率，阻滞细胞于G0/G1期，S期细胞比例减少，诱导白血病细胞凋亡率增加。

而T LRs是介导天然免疫反应并桥接或触发适应性免疫[10-11]，有研究报道T LR1～8在急性髓系白血病(AML)细胞株U 937细胞均有表达，且运用TLR8受体激动剂ssRNA40/LyoVec能显著抑制 U937细胞增殖，阻滞细胞于G0/G1期，但无明显的促凋亡作用[12-13]。本研究发现100 ng/m L脂多糖较对照组而言，能显著地抑制白血病细胞株U 937、HL60的增殖，增加G1期细胞的比率，阻滞细胞于G0/G1期，S期细胞比例减少、细胞凋亡率增加。

α-干扰素与脂多糖均能抑制细胞增殖和促进细胞凋亡，本研究中将两者以1∶1处理白血病细胞株U937、HL 60，发现两者联合后较单用其中一种，其白血病细胞的增殖抑制率、细胞凋亡率及阻滞细胞周期均有显著提高(P＜0.05)。这与Manfred等[4]报道α-干扰素联合脂多糖能明显增强白血病细胞的凋亡相一致。其机制可能在脂多糖处理白血病细胞后启动Toll样受体发生级连反应，促发机体的免疫反应，增强α-干扰素的协同抗白血病效应。也可能是两者联合处理细胞后，激活细胞内外多条信号通路，导致Caspase-8等活化进一步加强，促进细胞外凋亡途径加强，并释放一些凋亡相关蛋白如Fas等促发线粒体介导的细胞凋亡，从而进一步增强细胞凋亡[14-15]。

综上所述，α-干扰素与脂多糖联合使用可协同增强抗白血病作用，将为IFN-α协同 TLR激动剂或 TLR配体佐剂的使用为临床免疫治疗白血病提供坚实的理论依据。

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