栾焕玲 孙蕾娜 董娜 郭燕 孙保存 战忠利

天津医科大学附属肿瘤医院病理科，天津市肿瘤防治重点实验室，天津市肺癌诊治中心，天津 300060

近年来，肺癌的发病率和死亡率迅速上升，已跃居我国甚至世界恶性肿瘤的首位。虽然当前治疗技术有了很大提高，但5年生存率并没有明显改善。研究证实表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor，TKI）在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），尤其在肺腺癌的治疗中已取得较好的疗效，但肺癌患者对EGFR-TKI的敏感性与EGFR基因突变密切相关［1］。对于EGFR蛋白表达水平与EGFR-TKI敏感人群的选择，以及与EGFR基因突变的相关性目前尚存在争议［2-3］。K-ras基因是EGFR途径下游的一个重要的信号分子，它的突变可以导致EGFRTKI原发性耐药，是预后不良的指标。而目前关于K-ras蛋白表达与基因突变相关性研究还很少，两者之间的相关性有待进一步探讨。

1 材料和方法

1.1 病例样本及患者资料 留取2009年3月—2009年8月间天津医科大学附属肿瘤医院行手术切除的200例NSCLC患者的肿瘤新鲜组织标本，冰冻保存。所有肿瘤组织均制备组织切片并行HE染色,并由2 名病理医师采用双盲法确诊为NSCLC。其中男性117例，女性83例；年龄20～79岁；有吸烟史者120例；腺癌111例，鳞癌68例，腺鳞癌8例，大细胞癌9例，肉瘤样癌4例；85例患者存在淋巴结转移。

1.2 试剂 EGFR兔抗人单克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；K-ras鼠抗人单克隆抗体，购自福州迈新生物技术开发公司。

1.3 方法

1.3.1 序列检测 取肿瘤组织约25～30 mg，机械剪碎。采用E.Z.N.ATMTissue DNA Kit（购自Omega公司）提取基因组DNA，实验步骤，按照操作说明书。而后取1 μL DNA样本，行1%琼脂糖凝胶鉴定DNA样本进行质量检查以及浓度估计。

采用PCR方法扩增EGFR基因的4个外显子（18、19、20和21）和K-ras基因第2外显子，引物序列见表1。PCR反应体系总体积为20 μL：1’ HotStar-Taq缓冲液，2.0 mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTP，上、下游引物各0.2 μmol/L，HotStarTaq聚合酶（Qiagen Inc.）1 u和10 ng模板DNA。PCR反应条件为：94 ℃ 15 s、56 ℃30 s、72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸2 min。PCR产物经纯化后，用ABI 3130XL测序仪进行序列分析（基因测序工作由上海天昊生物科技有限公司负责）。用Polyphred软件分析，并结合人工校对后比较测序结果与基因库中EGFR基因序列（NM_005228.3）的差异。

表1 PCR法检测EGFR 18-21外显子和K-ras第1外显子特异性引物序列Tab.1 Specific primers of EGFR 18-21 exons and K-ras exon 1 in PCR detection

1.3.2 免疫组织化学检测 所有标本均经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，按4 μm连续切片，烘干。采用SP法行EGFR和K-ras蛋白检测（2种抗体稀释度均为1∶100）并设立阴性对照。EGFR蛋白着色定位于细胞质和细胞膜上，评分根据着色的细胞所占百分比和染色强度综合评价，≤10%记为（-）；>10%者淡黄色记为（+），棕黄色记为（++），棕褐色记为（+++）。K-ras蛋白定位于细胞核，评分也是根据着色的阳性细胞百分比和染色强度综合评价。阳性细胞百分比：0为0分，≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分和>75%为4分。染色强度以多数细胞的显色反应为准，无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。将两项指标评分相加，根据总分数划分为4级，即0～1分(-)；2～3分(+)；4～5分（++）；6～7分（+++）。将(-)和（+）记为阴性，将（++）和（+++）记为阳性。

1.4 统计处理 采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。各项比较均采用χ2检验，双侧检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基因突变及其与临床病理学特征之间的关系

2.1.1 测序检测基因突变 200例样本中，66例携带有EGFR基因突变（33%），其中外显子18发生突变的有3例，外显子19发生突变的有37例，外显子20发生突变的有2例，外显子21发生突变的27例，有3例患者同时携带有两个外显子的突变，分别为19和21、18和20以及18和21号外显子同时突变（图1）。

11例携带有K-ras基因突变，突变率5.5%，均为点突变，其中10例位于第12密码子，1例位于第13密码子吗，其中G12A 6例（最常见），G12C 2例，G12S 2例，G13V 1例。在本次研究中尚未发现同时携带有EGFR和K-ras 2个基因发生突变的样本。

2.1.2 基因突变与临床病理学特征之间的相关性 200例NSCLC患者中，EGFR基因发生突变的总例数为66（33%），其中腺鳞癌突变率为87.5%，腺癌为50.5%，明显高于鳞癌2的.9%、大细胞癌的1例（11.1%）和肉瘤样癌0例（0%）（P<0.05）。细支气管肺泡癌(bronchioloalveolar carcinoma，BAC)和含BAC成分的混合型腺癌突变率为61.3%，明显高于不含BAC成分的腺癌27.8%（P<0.05）。女性患者突变率51.8%，明显高于男性患者的19.7%（P<0.05）。<65岁年龄组突变率41.2%，明显高于≥65岁年龄组17.4%（P<0.05）。无吸烟史患者突变率52.5%，明显高于有吸烟史患者20.0%（P<0.05）。EGFR基因突变和有无淋巴结转移之间并无统计学差异（P>0.05，表2）。

K-ras总突变例数11例（5.5%），其中腺癌7例；9例为吸烟者；8例为男性。

图1 基因突变测序分析Fig.1 Sequencing analysis of gene mutation

2.2 EGFR和K-ras蛋白表达与临床病理学特征之间的关系 免疫组织化学检测结果显示，EGFR阳性表达的为32例（16.0%）。其中无吸烟史者阳性表达20例（25.0%），明显高于有吸烟史者12例（10.0%）（P<0.05）；5种病理类型之间经比较，差异有统计学意义（P<0.05）；但与患者的年龄、性别和有无淋巴结转移无明显相关（P>0.05，表2，图2A）。

K-ras阳性表达的为105例（52.5%），5种病理类型之间经比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与患者的年龄、性别、吸烟史和有无淋巴结转移之间，差异亦无统计学意义（P>0.05，图2B）。

2.3 蛋白表达与基因突变的关系 EGFR蛋白表达与总的基因突变例数以及18、20和21号外显子的突变，经统计分析，结果显示差异均无统计学意义（P>0.05）；但和19号外显子的突变，差异有统计学意义（P=0.043），19外显子有突变者EGFR蛋白阳性率为27.0%，19外显子无突变者阳性率为13.5%。统计学分析显示，K-ras蛋白的表达与其基因突变无相关性（P>0.05）。

表2 EGFR、K-ras基因突变和蛋白表达情况与各临床病理参数对比分析Tab.2 The comparative analysis of EGFR, K-ras gene mutations and protein expression with clinicopathological parameters(χ2 test)

图2 EGFR和 K-ras蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达Fig.2 Expression of EGFR and K-ras protein in non-small cell lung cancer tissues(DAB, ×400)

2.4 基因突变和蛋白表达与吉非替尼治疗效果的关系 随机调查25例服用吉非替尼的患者（Ⅲ期患者5例，其余20例皆为Ⅳ期，随访时间自2009年3月起，截止到2009年11月30日），其中15例检测出携带EGFR突变，12例（其中8例EGFR蛋白表达阴性，4例蛋白阳性病例中3例突变位于19号外显子）患者有效（80%）；10例未发现EGFR突变的患者为2例有效（20%），经比较两者差异有统计学意义（P=0.005）。对蛋白表达的统计分析显示，EGFR表达阳性者有效率为66.7%，阴性者有效率为52.6%，两者之间差异无统计学意义（P=0.661）。25例患者中无K-ras基因突变者；K-ras蛋白阳性表达者，有效率为54.5%，阴性表达者有效率为57.1%，两者之间差异同样无统计学意义（P=1.000）。

3 讨 论

多项研究显示EGFR基因突变与EGFR-TKI敏感性呈显著正相关，EGFR突变型患者对EGFR-TKI应答率可达65%～83%，而野生型患者仅10%～15%。Tamura等［1］对ⅢB/Ⅳ期NSCLC患者的研究证实EGFR突变患者对吉非替尼应答率可达75%，疾病控制率达96%，无进展中位生存期11.5个月，1年生存率79%。本研究中同样发现EGFR基因突变者对吉非替尼有效率达到80%，而野生型则仅为20%，提示 EGFR基因突变是选择接收EGFR-TKI吉非替尼治疗的重要指标之一。

本研究中检测发现，EGFR基因突变率为33%，显著高于北美地区的3%～25%和南欧地区的10%～24%［4］。突变的发生主要集中发生在EGFR基因19和21外显子中，分别占到总突变的56%和41%；19外显子大都为框架缺失突变；21外显子都为L858R点突变；统计结果显示，在女性、非吸烟者和腺癌（特别是BAC及含有BAC的混合型腺癌）患者中发生率更高，这与以往的文献报道一致［5］。同时发现<65岁年龄组EGFR基因突变率明显高于≥65岁年龄组患者（P<0.05），说明较年轻患者EGFR基因突变率更高，对EGFR-TKI更敏感。另外，本研究发现腺鳞癌突变率达87.5%，高于腺癌的50.5%，这可能与腺鳞癌例数少（8例）有关。Kang等［6］利用激光纤维切割的方法将腺鳞癌中腺癌和鳞癌分离，随后分别检测两者EGFR基因突变的情况，结果显示两种不同类型的肿瘤组织之间EGFR基因突变状态是一致的，说明两者很可能起源于同一祖细胞；还发现腺鳞癌患者EGFR基因的突变率以及临床特征与腺癌相一致（即腺鳞癌EGFR基因突变率也主要发生于女性和非吸烟者中），表明腺鳞癌对EGFR-TKI敏感人群的选择可以参照腺癌。

据文献报道，EGFR蛋白在NSCLC中阳性表达率大多在50%以上，而本研究结果显示仅为16%，但这与Dacic等［7］在NSCLC中的研究结果相似（15.9%）。导致差异的原因可能有：抗体选择不同，评分标准不一和评分的主观性等。EGFR蛋白表达能否用于指导EGFRTKI应用尚存在争议。多项研究显示EGFR蛋白表达与基因突变之间不存在一致性［8-10］。但也有少量研究显示，服用EGFR-TKI的患者，蛋白过表达组生存期要比阴性组长［3］，且在EGFR基因突变与EGFR-TKI相关性未发现之前，临床医生主要就是根据是否有EGFR蛋白表达来指导应用EGFR-TKI的。本研究显示，EGFR蛋白过表达与EGFR基因总突变之间无相关性，但与19号外显子突变存在显著正相关（其机制尚不清楚）。12例（EGFR突变型）服用吉非替尼有效的NSCLC患者中蛋白阴性8例，而阳性表达只有4例，另外，治疗无效患者中还有2例蛋白表达阳性。在这种情况下如果选用蛋白表达来指导吉非替尼的话，将有8例理论上有效的患者不能接受吉非替尼治疗，而有2例理论上无效的患者接受过度治疗，从而造成医疗资源浪费和患者经济损失。因此笔者认为基因检测是指导EGFR-TKIs最优先选择的手段。只有当基因检测受到限制或检测失败时，蛋白表达才可在一定程度上用于指导。

本研究显示K-ras基因突变可导致患者对EGFR-TKI的原发性耐药，是预后不良的指标［11］。本研究检测结果显示，K-ras基因的突变率仅为5.5%，显著低于西方人群的19.0%［12］。且K-ras基因突变更多见于男性和吸烟患者，与文献报道一致。目前尚没有发现同时携带EGFR和K-ras基因突变的病例，说明二者的存在是相互排斥的。因此K-ras基因突变状况的检测对于指导EGFR-TKIs的使用也是必要的。本组研究中K-ras蛋白阳性表达率为52.5%，与K-ras基因突变之间不存在相关性（P=0.27）。对25例服用吉非替尼患者的研究结果显示，K-ras蛋白的表达与吉非替尼疗效间无相关性。

综上所述，现阶段预测EGFR-TKI疗效的指标主要有：EGFR基因突变状态，EGFR基因拷贝数和EGFR蛋白表达。前两者已经被多项实验证实与EGFR-TKI敏感性呈显著正相关。而EGFR表达与EGFR-TKI的相关性，目前尚存在争议，需进一步证实研究。

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