彭立强 谢 云 任涛涛 陈五岭

饲料添加剂是添加在饲料中的一种可食性物质，以提高动物的营养水平及补充足够的营养。最初，饲料添加剂使用最普遍的主要是抗生素。但抗生素进入动物肠道后，除了杀死致病菌，还会破坏肠道正常菌群，致使动物免疫力下降，而且抗生素还存在残留和抗药性等问题。为此，抗生素在饲料中的使用受到了严格的限制。微生态制剂是一种新型饲料添加剂，又叫微生物饲料添加剂，它能很好地克服抗生素的不足。微生物饲料添加剂是以微生态调控理论为指导，利用动物体内正常微生物及其代谢产物或生长促进物，经培养、发酵、干燥、加工等特殊加工工艺制成的可直接饲喂动物的活菌制剂。微生物饲料添加剂具有增强动物免疫功能、防治疾病、提高生产性能的作用，既能确保食品安全，改善畜禽产品品质，又能减少畜禽排泄物的臭气，改善养殖场生态环境。

作为微生物饲料添加剂的核心组成成分，微生物菌种的优劣是决定后期发酵生产和产品最终应用效果的关键因素。在菌种筛选过程中，应着重考察其耐酸、耐胆盐的能力，以及对胃肠道环境的抵抗能力。而此过程中活菌计数的准确性，决定着我们对试验菌耐受能力的判断，关系到该微生物饲料添加剂的应用价值。通常，活菌计数的方法主要是平板稀释法、比浊法、菌体干重法等，但这些方法都不够理想，存在诸如工作量大、耗时长、误差大、不能区分死活细胞等缺点。本试验采用MTT比色法进行活菌计数。该方法是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶将外源性的MTT还原为难溶性的紫蓝色结晶物甲瓒(Formazan)，用二甲基亚矾将其溶解释放，再用酶联免疫检测仪测定OD值，OD值的高低可间接反映活细胞的数量。MTT法简单快速、重复性好、能够较准确地区分死活菌体细胞。

目前公认能作为微生态制剂的菌种包括：乳酸菌类、芽孢杆菌类、酵母类、霉菌类及光合细菌等。本文的目的是根据微生态理论，选用嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌、酿酒酵母作为试验菌株，研制能应用于养猪生产的优质高效的复合微生物饲料添加剂。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验菌：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)，均为本实验室保藏菌株。

指示菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium），为本实验室自天津宝迪京丰养殖场发病猪体内分离鉴定的菌株。

1.2 培养基及主要试剂

1.2.1 培养基

①嗜酸乳杆菌培养基：MRS培养基；②纳豆芽孢杆菌培养基：LB培养基；③酿酒酵母培养基：豆芽汁蔗糖培养基；④指示菌培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。

1.2.2 主要试剂和仪器

猪胆盐（上海源聚生物科技有限公司生产）；胃蛋白酶、胰蛋白酶(上海生工生物工程技术服务有限公司提供)；MTT（噻唑蓝）(北京伯乐泰克生物有限公司生产)；DMSO(二甲基亚矾)(上海菲达工贸有限公司和桥分公司生产)；超净工作台(SXK-103)；DHP-9272电热恒温培养箱（上海-恒科技有限公司生产）；多孔板分光光度计(酶标仪，BIO-RAD-550，美国生产)。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的筛选活化及菌悬液的制备

①取出冷冻保藏的8株嗜酸乳杆菌经MRS固体培养基连续活化3～4次后，分别测量pH值和活菌数，初筛出产酸和生长较快的菌株，37℃厌氧培养24 h，用无菌生理盐水稀释成菌数为107CFU/ml的菌悬液作为试验菌液A。

②纳豆芽孢杆菌接种于LB固体培养基中，活化3～4次，镜检后挑选生长旺盛、芽孢产生正常的菌株，扩大培养后用无菌生理盐水稀释为菌数107CFU/ml的实验菌液B。

③酿酒酵母先在豆芽汁蔗糖固体培养基活化3～4次，再接种到以淀粉为唯一碳源的平板上，根据透明圈大小，从中挑选淀粉酶活性最强的菌株，扩大培养后制成的实验菌液C，菌数为107CFU/ml。

④大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，活化3～4次后，制成菌数为107CFU/ml的指示菌液D、指示菌液E。

1.3.2 抑菌实验

本实验采用牛津杯法，以大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌作指示菌，对试验菌株嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌的抑菌效果进行检测（酿酒酵母对肠道病原菌的抑制效果不明显，在抑菌实验部分不予讨论）。自指示菌液D、指示菌液E中分别取0.4 ml加入培养基中，加入15 ml放冷至50℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，混匀，作为菌层，置于37℃干燥冷却30 min，待其充分凝固。在无菌条件下，将3个无菌不锈钢牛津杯等距放置于培养基表面，分别吸取0.25 ml实验菌液A、实验菌液B和AB混合液（每个试验菌3个重复）37℃恒温培养24 h，用游标卡尺准确测量抑菌圈的直径，计算其平均值。

1.3.3 耐酸实验

将上述实验筛选出的菌株活化后，分别以2%的接种量，依次接种于pH值为2.0、3.0、4.0、5.0的3种实验菌的液体培养基（MRS液体培养基、豆芽汁蔗糖液体培养基、LB液体培养基）中，37℃培养16 h，用MTT比色法测其活菌浓度。

1.3.4 耐胆盐实验

初筛：将上述实验筛选出的3种菌株按点种法分别接入到对应的3种固体培养基（加猪胆盐0.3%）中，37℃恒温培养3～4 d后观察(重复3次)。挑选生长良好的菌株进入下一步实验。

复筛：在3种液体培养基中分别依次加入0.1、0.2、0.3、0.4 的猪胆盐(w/v，%)，121 ℃灭菌 15 min。将初筛获得的3种菌株接入上述已处理好的液体培养基中，同时接种不含猪胆盐的培养基中作为对照。37℃，140 r/min摇床培养18 h，用MTT比色法测其活菌浓度。

1.3.5 人工模拟猪体胃肠道耐受性实验

1.3.5.1 人工胃液的耐受性实验

人工胃液的配制：NaCl 0.2%、胃蛋白酶0.35%，用1 N HCl调整pH值为3.0后，用细菌过滤器过滤后备用。

将试验菌液A、B、C以10%的接种量接入到人工胃液中，37℃、140 r/min摇床培养，以0 min时为对照，分别于 60、90、120 min取样，MTT法测其活菌数，并计算存活率，重复3次取平均值。

1.3.5.2 人工肠液的耐受性试验

人工肠液的配制：将下述a液和b液以2：1混合即为人工肠液。

a胰腺液：NaHCO31.1%、NaCl 0.2%、胰蛋白酶1%，调整pH值为3.0后，过滤除菌后备用。

b胆液：猪胆盐1.2% ，调整pH值为8.0后，过滤除菌备用。

将试验菌液A、B、C以10%的接种量接入到模拟肠液中，37 ℃，140 r/min摇床培养，分别于 0、60、120、240 min取样，MTT法测其活菌数，并计算存活率（重复3次，取平均值）。

1.4 分析方法

1.4.1 MTT法测活菌数

此法是通过检测光密度值变化来间接反映菌体活细胞数量的变化，只有在一定细胞浓度范围内，甲瓒生成量才与活细胞数目呈正相关。因此，比色前必须对培养液中菌体浓度进行处理：菌液浓度过低时，浓缩后再测定；若过高时，先稀释，使其OD值在0.2～1.0的范围后，再测定。魏鸿刚等认为：当样品中活菌浓度在1×107～1.4×108CFU/ml范围内时，光吸收值与待测样品的活菌浓度之间的线性关系较好。具体实验步骤如下：

①PBS溶液配制：8 g NaCl、1.15 g磷酸氢二钾，0.2 g磷酸二氢钾去离子水定容至1 000 ml，用pH计调节pH值7.2，溶液浓度为0.01 mol/l。121℃灭菌15 min，室温保存。

②MTT溶液配制：称取100mgMTT于小烧杯中，加 20 ml PBS(0.01 mo/l，pH 值 7.2)，使其充分溶解，用0.22 μm微孔过滤器除菌，分装于1.5 ml的EP管中，4℃棕色瓶中避光保存。两周内使用有效。

③标准曲线的绘制：取3种实验菌的菌液，用无菌生理盐水进行倍比稀释，选择10个合适的浓度，分别对其做MTT比色实验和平板菌落计数。根据OD值和活菌数作出3种实验菌各自的标准曲线，并求出回归方程。

④MTT比色实验：A：将培养液进行浓缩或稀释，使其活菌浓度满足比色要求；B：吸取处理好的培养液100 μl，加入96孔酶标板中，每个样液做5个复孔，同时设阴性对照；C：用微量吸样器在96孔酶标板中含有样品的各孔分别加入20 μl的MTT溶液，37℃恒温培养1.5 h后取出，向各孔分别加入100 μl的DMSO，用全自动酶标仪于570 nm处测定OD值，测量前振动60 s。所得OD值代入回归方程计算出活菌数。

1.4.2 pH值的测定

用ORION RESEARCH model 221型酸度计测pH值。

1.4.3 统计方法

为了便于进行统计学分析，将活菌数CFU/ml换算成对数值。

所有实验结果至少重复3次，所得数据用Excel2007和SPSS17.0进行计算和分析，结果用均数±标准差(±sd)的形式给出。

2 结果与分析

2.1 抑菌实验结果（见表1）

表1 抑菌实验结果（mm）

从表1可以看出，嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌这两种实验菌对指示菌均具有一定的抑制活性。其中，对大肠杆菌抑菌活性最好的是纳豆芽孢杆菌，其抑菌圈直径为15.67 mm；对鼠伤寒沙门氏菌抑菌能力最好的也是纳豆芽孢杆菌，其次是嗜酸乳杆菌，两种菌抑菌圈大小分别为14.95和13.67 mm；混合菌液对大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌也均具有抑菌作用，其抑菌圈直径分别为14.91和13.33 mm。说明各实验菌株对指示菌均有一定的抑菌效果，且两菌种混合后对病原菌仍表现出较强的抑菌作用。

2.2 耐酸实验结果

因饮食结构等的状况的不同，动物胃液pH值的波动较大，如猪胃中的pH值常在2.0～7.0之间，但一般在3.0左右，因此，以此pH值作为菌株筛选的标准。

由图1可知，随着培养基pH值的逐渐降低活菌含量也随之下降。在pH值5.0时，各试验菌均表现出较好的增殖现象，嗜酸乳杆菌的活菌数对数值达到了7.35。pH值4.0时，3种菌的活菌数有所下降，活菌数均小于107；当pH值下降至3.0时，3种试验菌仍然表现一定的耐受能力，活菌数均在106左右。其中，嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌的存活能力比酿酒酵母要好。在pH值为2的强酸性条件下，纳豆芽孢杆菌的存活能力较其余两菌要好，活菌数在105以上。由此，说明筛选出的3种试验菌（尤其是纳豆芽孢杆菌）均具有较好的抗酸能力，能顺利通过高酸性胃液环境进入肠道。

图1 不同pH值对菌数含量的影响

2.3 耐胆盐实验结果

微生物饲料添加剂对胆盐的耐受性是决定其进入猪体内能否发挥生理功能的又一关键因素。胆盐是由肝脏合成的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合形成的钠盐或钾盐，经胆道分泌进入小肠，动物肠道中的胆汁盐含量是不断变化的，一般在0.3～3.0 g/kg，通常情况下其平均含量为0.3 g/kg，所以通常将0.3 g/kg作为筛选耐胆汁盐菌体的标准。

图2 不同胆盐浓度对实验菌活菌数的影响

由图2可知，嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌、酿酒酵母在胆盐浓度为0.1%、0.2%时均能很好的生长繁殖，其中纳豆芽孢杆菌的耐胆盐能力较强，活菌数均大于107CFU/ml；当猪胆盐浓度增加为0.3%时，3种试验菌都表现出较好的增殖现象，其中纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的增殖较明显，活菌数都在106以上；当胆盐浓度为0.4%时，纳豆芽孢杆菌生长状况一般，而嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的生长受到较明显抑制，但活菌数仍大于104。说明嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌、酿酒酵母对胆盐均具有一定的耐受力。

2.4 人工模拟猪体胃肠道耐受性实验结果

2.4.1 人工胃液的耐受性实验结果

动物胃液的成分主要有：盐酸、胃蛋白酶原、粘蛋白等。胃蛋白酶原在HCl激活下转变为有活性的胃蛋白酶，消化食物。流体食物在胃内经阶段性运动消化一般需要1～2 h。菌株对胃酸及胃蛋白酶的耐受性越强，能够到达肠道的活菌数越多，则越能最大限度地发挥效应。人工模拟猪体胃液实验的结果见表2。

由表2所示，在人工猪体胃液中，3种实验菌在人工胃液中的活菌数随着时间的延长逐渐降低，作用2 h活菌存活率均在70%以上，即大部分试验菌耐受人工胃液环境的时间超过2 h。说明筛选出来的3种实验菌通过猪体胃液环境进入肠道的可能性较大。

2.4.2 人工模拟肠液的耐受性实验结果

猪体消化道肠液中含有胰蛋白酶和胆汁盐，对菌株的存活有很大的影响。小肠液是一种弱碱性液体，pH值约为7.6。食物在小肠内停留时间较长，约3～5 h。另外，胆汁盐具抗菌性，可溶解细菌细胞，活菌进入肠道后，要对环境具有一定的持续耐受能力，才能保证其正常发挥作用。人工模拟猪体肠液实验结果见表3。

由表3可知，实验菌对人工猪体肠液具有较强的耐受能力，3种实验菌的存活率都在80%以上，耐受时间可超过5 h。其中，纳豆芽孢杆菌经人工胃液处理5 h后的存活率仍大于85%。由此说明3种实验菌通过猪体肠液环境存活的可能性较大。

2.5 标准曲线的绘制

多数报道表明，甲瓒在570 nm下的光吸收值与细胞活性正比关系最佳，本文选取570 nm测定OD值。此外，不同益生菌的琥珀酸脱氢酶的活性各不相同，为了更精确的反映培养液中的活菌数，本文准确地绘制了3种实验菌各自的标准曲线。

以MTT比色法所得OD值为X轴，以平板稀释法所得活菌数为Y轴作标准曲线。3种菌的标准曲线见图3、图4、图5，3种菌的线性回归方程为：

①嗜酸乳杆菌：线性回归方程：y=1.497 3x+0.001 7，R2=0.984 7；

②纳豆芽孢杆菌：线性回归方程：y=1.380 5x+0.017 4，R2=0.986 7；

③酿酒酵母：线性回归方程：y=1.484 2x+0.009 3，R2=0.985 5。

表2 实验菌的人工胃液实验（pH值为3.0）

表3 实验菌的人工肠液实验

图3 嗜酸乳杆菌的活菌数与OD570 nm的关系

图4 纳豆芽孢杆菌的活菌数与OD570 nm的关系

图5 酿酒酵母的活菌数与OD570 nm的关系

3 讨论与结语

由于猪体胃肠消化道不断分泌胃液、胆汁、胰液等消化液，对微生物构成一道酶和低pH值的屏障。复合益生菌需对胃肠道较强的酸性环境、较高浓度的胆盐和各种消化酶具有一定的耐受能力，这样才能保证其进入消化道，并定植于肠道内，发挥调节肠道菌群平衡的作用。

所选3种试验菌：嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌及其混合菌液对大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌均具有明显的抑制作用，在pH值3.0时，3种实验菌的活菌数均在106左右，其中，嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌的酸性环境存活能力比酿酒酵母要好。在0.3%猪胆盐的环境中，3种实验菌都表现出较好的增殖现象，其中纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的增殖较明显，活菌数都在106以上。另外，人工胃肠道实验结果表明：3种实验菌通过猪体胃液环境存活的可能性较大，3种实验菌在人工胃液中作用2 h活菌存活率均在70%以上；3种实验菌对人工猪体肠液具有较强的耐受能力，存活率都在80%以上，耐受时间可超过5 h。其中，纳豆芽孢杆菌经人工胃液处理5 h后的存活率仍大于85%。

由本实验所筛选的3种实验菌（嗜酸乳杆菌、纳豆芽孢杆菌、酿酒酵母）均可以通过胃液到达小肠发挥作用。所选菌株对病原菌、尤其是猪体高致病菌有较强的抑制作用，具备了优良益生菌的条件，我们将进一步摸索发酵实验条件、研究生产制备工艺，制成固体微生物饲料添加剂，并将其应用到生产实践中，进行猪的饲喂实验，以检验其应用效果。

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