胡 峰，崔玉东，崔尚金

(1.中国农科院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病学研究室，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江八一农垦大学动物科学技术学院，黑龙江 大庆 163319)

猪瘟（swine fever， hog cholera），我国俗称烂肠瘟，欧洲为了区别于非洲猪瘟称其为古典猪瘟（classical swine fever，CSF）。病原是猪瘟病毒（CSFV），属黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（estivirus） 。猪瘟被国际畜疫会和欧盟列为须申报的动物传染病，我国也将其列为一类传染病。该病于1833年首先发现于美国的俄亥俄州，自1983年开始暴发的百余年来，己经遍布全世界，给养猪业带来了巨大的经济损失。1997年在荷兰暴发了CSF，1993年到2000年在德国暴发，比利时和意大利20世纪90年代也相继暴发CSF。尽管世界各养猪大国对CSFV给予了足够的重视，但是由于参差不齐的疫苗质量，不合理的引种、免疫程序以及野猪群也携带猪瘟病毒等因素，致使CSF目前仍是威胁各国养猪业的一个极重要的传染病，因此长期以来，猪瘟一直是兽医疫病研究的重点和热点之一。

1 诊断方法

近年来，猪瘟的流行和发病特点发生了很大变化，CSF的发病早期不表现出所有的症状，而且表现的症状也越来越不明显，没有单一的症状能确诊CSF。被CSFV感染的猪发烧出现的败血症与沙门氏菌、放线杆菌、嗜血杆菌等引起的败血症状和病变相似，所以也不容易区分。CSFV与牛病毒性腹泻病病毒（BVDV）同属于瘟病毒属，在结构上、遗传性以及抗原性上密切相关，所以与CSFV存在血清学交叉反应，对猪瘟的诊断造成了干扰。此外，猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）的大规模应用，也给CSFV野毒感染猪和疫苗感染猪的血清学鉴别诊断带来较大困难，欧盟已经禁止使用传统弱毒疫苗。目前感染CSFV的活猪主要通过对全血中的病毒或病毒核酸以及血清中抗体的检测进行诊断，对感染了CSFV的病死猪主要检测器官中的病毒、病毒核酸以及抗原进行诊断。

1.1 病原学检测

1.1.1 病毒分离与鉴定

取病变组织（扁桃体、脾脏、淋巴结等）研磨成乳液，离心、过滤后，接种于PK-15细胞上培养，其他细胞系也可以用于病毒分离，但它们至少和PK-15对CSFV有相同的敏感性。培养24～72 h后可以用免疫荧光抗体试验（FAT）进行检测，也可以在4～5 d后固定，用免疫过氧化物酶染色法检测。该方法的敏感性比冷冻切片免疫荧光试验的敏感性高，但是速度慢，花费较长时间。

肝素或EDTA处理猪的全血可以用于CSF的早期诊断，该方法比利用血细胞的某些成分进行CSF的早期诊断敏感性高，操作简便。在－20 ℃条件下冷冻全血样本，并在37 ℃条件下水浴融化。将血细胞溶解的血液接种到单层生长的PK-15细胞上，37 ℃孵育1 h。接种后3～4 d，用PBS洗板，固定，染色，最后用过氧化物酶中和试验检测。该方法的缺点是在诊断急性CSF时的敏感性低于传统的病毒分离方法。

1.1.2 猪瘟兔体免疫交互试验

猪瘟强毒不引起家兔体温反应，但能使其产生免疫力，猪瘟兔化弱毒（HCLV）能使家兔产生定型热反应，但对已产生免疫力的家兔则不产生体温反应。将病料乳剂接种健康家兔，7 d后用兔化猪瘟弱毒注射家兔，24 h后每6 h测温1次，连续3 d。无定型热反应，说明病料中含有猪瘟病毒。

1.1.3 免疫荧光抗体试验（FAT）

FAT是一种快速检测存在于扁桃体、脾脏、肾脏、淋巴结或回肠远侧部CSFV抗原的方法。各种组织器官需要来自不同的患病猪，并且在低温运输过程中不能使用一些防腐剂。将冷冻切片直接用连有异硫氰酸荧光素（FITC）的抗CSF免疫球蛋白染色，然后在荧光显微镜下观察。在感染初期扁桃体最先受到影响，所以扁桃体最适合用此方法检测。患有亚急性和慢性CSF的病猪，FAT检测回肠常显阳性，有时是唯一显示荧光的部分。这种方法敏感性高、可靠。但是FAT方法对实验操作人员的操作技能和荧光分析等要求很高，否则会出现较高的错误率，通过FAT检测为阴性的不能完全排除没有受到CSFV的感染。FAT中使用的抗CSF的免疫球蛋白不能将瘟病毒属中不同种的抗原区分开。用于FAT的连接物必须是由来自无特定病原体猪的抗CSFV γ-球蛋白制备的。该方法只能用于新近死亡的动物，因为自我溶解和细菌污染都会造成荧光显色时背景着色较深，不易观察。

1.1.4 鸡新城疫病毒强化试验（END）

猪瘟病毒与NDV在猪睾丸细胞上均不产生细胞病变（CPE）。在一定条件下，先被CSFV感染的猪睾丸细胞，随后再感染NDV时可产生CPE。这一现象称为新城疫病毒强化试验（END）。具体方法是在猪睾丸细胞培养物中接种无菌处理的被检材料，传代适应之后再接种NDV，继续培养3 d，如果细胞出现病变，则表示有CSFV存在。Hao Xu等利用这一现象对CSFV的NS3蛋白进行了研究，表明NS3能诱导细胞凋亡。

1.2 血清学检测

血清学检测通常用于了解猪的群体免疫水平和对疫苗免疫效果进行评价，为预防接种提供科学依据。检测CSFV的抗体，在提前预测感染了低毒力CSFV的疑似猪中非常有用。因为CSFV具有免疫抑制作用，所以感染后21 d才能确切地检测到抗体。血清学调查的目的就是检测CSF的残留，特别是种畜群，同时还用于CSF扑灭的最后阶段的检测。利用单克隆抗体的病毒中和试验（VN）和ELISA能满足敏感度的要求。氧化物酶联中和试验（NPLA）和免疫抗体中和试验（FAVN）是应用最广泛的技术， 2个试验都可在微量滴定板上进行。

1.2.1 正向间接血凝试验（IHA）

抗原与相应的抗体在一定条件下结合形成抗原抗体复合物，但一般肉眼看不见这种复合物。若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，就能大大提高抗原抗体反应的灵敏性。毛文杰等将待检血清经56 ℃ 30 min灭活，在96孔血凝板上将待检血清、阳性血清和阴性血清用稀释液作倍比稀释，各稀释12孔，随后加入减半量的猪瘟间接血凝抗原，轻摇振荡均匀，室温放置2 h后观察结果，来检测猪的群体免疫水平，该方法操作简单、重复性好。

1.2.2 中和试验

中和试验原理是病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力。

荧光抗体病毒中和试验（VN）。将待检血清56 ℃ 30 min灭活后做适当稀释，与等体积的200 TCID50/0.1 mL的CSFV中和，然后接入PK-15细胞，维持液孵育2 d以上。采用直接免疫荧光方法进行检查，并设立对照组。可发现对照组有翠绿色光斑，而试验组光斑消失。其优点特异性强，操作简便，但不能定量。

过氧化物酶联中和试验（NPLA）。将待检血清稀释后与200 TCID50/50 μL的病毒液中和，然后接入细胞，待细胞长成单层后固定，加入高免猪抗CSFV血清，最后加入辣根过氧化物酶（HRPO）标记的抗猪IgG，作用后加入底物显色，根据颜色就可判定结果。

表面等离子体共振（SPR）试验。基于表面等离子体共振技术的蛋白芯片可用于检测抗体滴度，Gomes,P等人利用SPR试验对14个农场的170份血清样品进行检测，结果表明SPR试验具有较高的特异性和敏感度，并且没有交叉反应，与ELISA相比该方法是一种用于CSFV感染后的血清学诊断和免疫后抗体低度检测的快速的（总共需要1.5 h）有价值的工具。目前已经利用SPR试验直接对口蹄疫病毒、疫苗病毒、脊髓灰质炎病毒、烟草花叶病毒进行检测。

1.2.3 ELISA试验

1.2.3.1 捕获ELISA方法

为了快速诊断CSF，抗原捕捉ELISAs试验可用于新近疑似感染CSFV的畜群的筛选，ELISAs是一种双抗体夹层式，利用单克隆抗体或多克隆抗体检测血清中的病毒蛋白、血细胞以及血液中的抗凝因子。另外，某些试剂盒还用于纯化组织均质物。此项技术操作起来相对简单，不需要组织培养设备，便于自动化，只需半天就可出结果。但缺点是灵敏性比病毒分离方法的低，特别是对温和型和临床症状不明显的病例检测中灵敏性较低。这一缺点可以通过对所有的疑似发热畜群进行检测来得到补偿，然而在检测中还应考虑试验的特异性。该方法不适合单个患CSF的病例诊断。捕获ELISA能够检测2种不同猪瘟病毒株感染的病猪的血液和组织中的抗体。

1.2.3.2 间接ELISA法

首先包被抗原，将待检血清稀释后加入孔中，然后加入标记物，最后加入底物显色，酶标仪读数判定结果。Guo-zhen LIN等人利用大肠杆菌表达CSFV的E2中4个抗原表位，并作为包被抗原建立间接ELISA，特异性地检测猪血清样品中的抗CSFV抗体。结果表明，与间接血凝试验（IHA）相比，间接ELISA方法的敏感度是97.5%，特异性是96.7%。包被的抗原与抗牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗体之间无交叉反应。

1.2.4 单克隆抗体技术

用纯化的猪瘟病毒免疫BALB/ c小鼠，取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。经筛选最终获得了能稳定传代并分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备的单克隆抗体与其他抗原无交叉反应，能快速做出诊断。用过氧化物酶或异硫氰酸荧光素连接物标记的3种单克隆抗体，分别特定性的检测CSFV野毒株、CSFV疫苗株和反刍动物瘟病毒，一方面能准确的将CSFV野毒株与CSFV疫苗株区分开，另一方面能将CSFV与其他瘟病毒区分开。猪感染了CSFV后体内会产生针对结构蛋白Erns和E2以及非结构蛋白NS3的抗体，通过针对NS3的单克隆抗体表明NS3是保守的抗原表位，因此可以利用针对Erns和E2的单抗来区分猪瘟病毒属的不同种和同一种中的不同株。

1.3 分子生物学方法

1.3.1 反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

通过纯化感染了CSFV的PK-15细胞培养液，提取CSFV，设计引物，利用RT-PCR扩增5'端的非编码区和编码糖蛋白E2基因的目的片段，测序，并与数据库的序列进行比较，从而做出诊断。该方法是国际上认可的用于快速诊断CSF，它的灵敏度高于抗原捕捉ELISAs和病毒分离方法，所以它较适合于临床诊断。因其诊断的速度和敏感性现在已被欧盟一些国家所接受。但是该方法在操作时要防止实验室污染，以免造成假阳性，同时待检样品中含有抑制剂也会造成假阴性。对初次暴发CSF的地区诊断的阳性结果都须用其他方法进行确诊。CSF的分子流行病学基于不同病毒株的遗传差异，RT-PCR根据核酸序列扩增CSFV的RAN，这是获得用于比较的核酸序列数据最简单的方法。

1.3.2 套式PT-PCR

套式PT-PCR是一种基于限制性片段长度多肽性分析而建立起来的诊断方法，用于对CSFV基因亚型的分类和区分CSFV疫苗株和野毒株。Ning Chen等人基于对CSFV蛋白E2基因的限制性片段长度多肽性分析建立了套式PT-PCR，对来自中国东南部2003年到2008年间的321例临床样本进行检测，检出96例阳性样本，并对这96例阳性样本做进一步区分鉴定，鉴定出23例是感染疫苗株CSFV，62例是野毒株，11例是疫苗株CSFV与野毒株混合感染。

1.3.3 实时荧光定量聚合酶链式反应技术（FQPCR）

实时荧光定量PCR技术（FQPCR）在基因表达水平的分析、病原体的定性和定量检测等方面得到了广泛应用。在荧光实时PT-PCR技术中利用了非特异性的SYBR Green I作为染料和特异性的水解荧光探针Taqman（standard rRT-PCR）。Taqman探针是一条线性的寡核苷酸链，荧光染料在其5′端，淬火分子在其3′端，与互补DNA杂交后，在延伸过程中被具有5′-3′外切酶活性的Taq聚合酶降解，同时放出报告基因的荧光。Risatti等应用standard rRT-PCR对CSFV快速检测进行了研究，试验结果表明该方法的敏感性可以达到甚至超过病毒培养。目前Guoyuan Wen等人利用小沟结合探针（MGB）建立了MGB实时RT-PCR技术(MGB rRT-PCR)，MGB部位可以使探针更加牢固的结合到单链DNA上，因此在反应中可以提高解链温度，从而可以设计更短的特异性强的探针。结果表明，MGB rRTPCR技术的敏感度比standard rRTPCR技术和病毒分离方法高出10倍。检测261份现场样品，MGB rRT-PCR技术与standard rRT-PCR技术和病毒分离的检测结果一致性分别是93.3%和76.7%。Zhao JJ等人建立了多重实时RT-PCR，可定量的区分CSFV野毒株和疫苗株。

1.3.4 环介导等温扩增技术(LAMP)

LAMP是一种新型的，快速的，敏感性高的诊断技术，由日本的Notomi等人创建。RT-LAMP是在恒温条件下进行的，不需要额外的加热设备，只需要一个水槽和热带就能完成扩增，只需一个管将所有反应物混合在一起，63 ℃ 1 h。效率高，可以对大量的样品进行检测。基于此目前LAMP已广泛用于病毒诊断。针对CSFV编码区保守序列设计6条引物（2条外引物，2条内引物，2条环引物），倍比稀释病毒。灵敏度试验表明比RT-PCR高100倍，能检测到10-6稀释的103.84TCID50的CSFV。LAMP检测出13株CSFV，同时与其他非CSFV进行交叉反应，结果都是阴性。

1.3.5 PCR-ELISA

PCR-ELISA 是用免疫学方法检测PCR产物，即在PCR扩增后，在微量板上借用ELISA的原理，使用酶标抗体，进行固相杂交来实现定量。其原理是在进行PCR扩增时一个引物的5′端标记生物素，另一引物则在5′端标记显色基团（如FITC，用HRP标记的抗FITC结合显色），这样PCR产物就可结合到亲和素包被的塑料板上，靶序列被捕获。再在微孔中加入用HRP标记的抗体，抗体与靶序列上的抗原结合，再加入底物使之显色，可进行常规ELISA检测，设计已知标准对照，可进行定量。该方法的敏感性可与放射性核素标记相比，但又避免了核素的危险。

1.4 免疫胶体金技术

免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合。因此胶体金技术广泛地应用于免疫学、组织学、病理学等领域。顾建等人用免疫胶体金技术对20份血清进行检测，同时采用ELISA方法同比检测作对比，免疫胶体金技术检出阳性率是75%，ELISA方法检出率是90%。虽然免疫胶体金技术敏感度低，但具有简便、快速、并可单份操作的优点，步骤单一，实验过程时间20 min左右，无须仪器协助，且标本不易污染，适用于紧急检测。

1.5 基因芯片技术

基因芯片是近年来分子生物学与微电子学等多学科交叉融合而成的一项高新技术，指在一个很小的表面，通常是硅化玻璃，覆盖有成千上万的寡核苷酸，每一个固定在芯片上的特定位置，可以找到这个点，每个寡核苷酸反应芯片上成千上万拷贝互补信息。包括cDNA芯片、寡核苷酸芯片、基因组芯片。杨林采用基因测序为基础的系统进化树的分析方法，对黑龙江部分地区猪瘟病毒流行株进行分离鉴定和E2基因序列分析，并与传统石门强毒和猪瘟兔化弱毒苗在抗原基因上存在的变异进行了比较，结果表明：所检测的病料是CSFV感染、CSF流行毒株和疫苗株在核苷酸和氨基酸序列上存在一定差异，E2基因部分序列接近CSFV的Alfort株，与Brescia同源性最低。姜永厚等人究建立了一种基于多重PCR的寡核苷酸基因芯片检测和区分猪瘟病毒(CSFV)，猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的方法，对76个仔猪样本进行了检测，检出了3种病毒的存在，其中25个样本32.9 %同时感染了2种以上病毒。结果表明寡核苷酸基因芯片检测是一种快速、灵敏和高效的猪只混合感染病毒的病原学诊断方法。

2 疫苗研究进展

2.1 传统疫苗

自1903年De Sehweinitz和Dorset首次证明CSFV是一种滤过性病毒以来，人们采用各种免疫方法预防和控制猪瘟。最初应用的是高免血清，但由于高免血清昂贵，获取困难，加之血清有散毒的危险，因此高免血清的使用受到限制。后来出现许多灭活疫苗，其中福尔马林和结晶紫灭活苗曾被广泛应用。灭活疫苗虽然安全，但保存期短。所以人们开始研制弱毒活疫苗，其中应用较广的是中国的兔化弱毒疫苗株，日本的细胞弱毒疫苗GPE-株，法国的Thiverval株，这些弱毒疫苗在猪瘟控制中起着重要作用。但是，使用弱毒活疫苗免疫的猪群，在流行病学调查和猪瘟防治工作中，不能用血清学方法来区分自然感染猪群和免疫接种猪群，另外，弱毒活苗还有可能与野毒重组或进行自然突变而造成毒力返强，出现免疫耐受现象。目前欧盟一些国家已禁止使用传统疫苗，随着对CSFV分子水平研究的不断深人和分子生物学技术的不断进步，基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗成为研究的热点。

2.2 基因工程亚单位疫苗

CSFV中具有免疫原性，能产生中和抗体的蛋白是E0和E2，糖蛋白E2是CSFV免疫原性最好的蛋白，基于E2的亚单位疫苗具有保护性并能产生高滴度的中和抗体。可以利用真核细胞高效表达系统来表达猪瘟病毒免疫原蛋白，并以此表达产物为抗原制造疫苗。杆状病毒（Baculovirus）-昆虫细胞系统可高水平表达外源蛋白，昆虫细胞对蛋白质的加工和运转过程与哺乳动物类似，所表达的蛋白“仿真”程度较高。Hulst等将猪瘟病毒E2基因cDNA重组入核型多角体病毒，并在sf21细胞中表达，用20～100 μg的表达蛋白免疫猪，可抵抗100 LD50的猪瘟强毒攻击，其诱导产生的中和抗体水平远高于由弱毒疫苗免疫产生的水平。目前由于该疫苗生产技术具有安全、稳定、可规模化等优点，同时又可根据流行毒株的变化，更换合适的E2 基因，因此，具有广阔的应用前景。

2.3 病毒活载体疫苗

以无致病力或低毒力的痘苗病毒（VAC）和伪狂犬病病毒（PRV）为载体，将猪瘟病毒E2基因与之重组研制出的基因重组疫苗，免疫动物后可对2种病毒产生良好的保护力。对此类疫苗的安全性和实用价值目前还有争议，一旦将该病毒放入自然界中，将有可能衍变出对人、兽有危害的病毒变种。另一方面，伪狂犬病是较为普遍的一种疾病，猪瘟—伪狂犬病重组疫苗对于已感染或已免疫的动物不能产生保护力。Moormann等（1996）拼接出以C2株感染性全长cDNA，用强毒E2基因取代原有E2基因，构建出了猪瘟杂交病毒。Van Zijl等人将CSFV的E2蛋白基因重组到狂犬病病毒中，并进行高效表达，然后免疫猪，效果明显。

2.4 标记疫苗

该疫苗就是对猪瘟兔化弱毒进行改造，使其缺失某一段基因或某一段特殊片段，但其免疫原性不改变。以缺失的基因所表达的蛋白作为诊断抗原，能够区别疫苗接种猪和自然感染猪产生的抗体。便于及早发现感染动物，采取控制措施，可为在实施猪瘟“扑灭计划”时减少大量错杀导致的经济损失。De Smit等人将C株进行重组克隆出了新的重组疫苗株。G R Risatti等研究了E2亚单位标记疫苗在实验条件下的免疫保护情况并发现E2亚单位标记疫苗免疫效果明显。

2.5 DNA疫苗

DNA 疫苗是近年发现并形成的一种新的疫苗研制技术，以配有原核复制元件和真核表达调控元件的质粒为载体，将猪瘟病毒主要保护性抗原基因插入该质粒中，使病毒核酸在动物机体内进行表达，从而刺激机体产生免疫保护。Hammmond等用表达CSFV E2基因的裸露质粒DNA免疫6周龄断奶仔猪和7日龄提前断奶乳猪，再将这2组猪群均用表达E2基因的腺病毒重组体（rPAV-gp55）加强免疫一次，用CSFV攻毒后，100%的仔猪和75%的乳猪获得保护。但同时还应考虑核酸疫苗存在的安全性问题，Markowska Daniel等报道CSFV DNA 疫苗免疫猪后短时内体温可高达40 ℃以上，对猪体有一定的影响。由于该重组子可通过发酵培养方式大量制备，又具有相对较好的稳定性，并且大容量的质粒还可同时容纳多种病毒的免疫原基因，因此，这项制苗技术具有很大的研究价值。

3 防控中的几项实用技术

3.1 确定疫苗含量、并能和野毒感染进行鉴别的实用技术

主要包括RT-PCR（套式PCR技术和荧光定量PCR技术），胶体金等。

我国采用免疫猪瘟兔化弱毒疫苗很好地预防和控制了猪瘟在我国的大规模流行，疫苗含量是保证疫苗有效的关键因素。RT-PCR（套式PCR技术和荧光定量PCR技术），胶体金等可以进行此类工作。可以使基层兽医在疫情暴发时在现场确诊，及早采取措施控制疾病的流行。根据CSFV野毒和弱毒核酸序列差异建立的套式PCR技术和荧光定量PCR技术，能区分CSFV野毒和弱毒，主要用于进行实验室诊断，不适合现场检测，临床迫切需要一种能区分野毒和疫苗毒方法的出现，2006年出现了利用MGB探针建立了区分韩国5KLOM疫苗株和野毒株的方法；2008年国内有学者也建立了能区分HCLV疫苗株和野毒株的多重RT-PCR方法和FQ-PCR方法，前者由PCR后处理，易污染；后者虽不需后处理，但与前者一样，分2步进行，费时。

胶体金免疫层析技术是20世纪90年代发展起来的一种新型体外诊断技术。该诊断方法快速简便，操作简单，无需仪器，结果准确。其基本原理是利用微孔滤膜的渗滤浓缩和毛细层析作用，使抗原抗体在固相膜上反应，然后用胶体金标记的抗体显色，阳性反应在膜上呈现红色，阴性反应则不出现红色。已经报道的猪瘟胶体金诊断技术，主要基于猪瘟病毒抗体定量检测和病原定性检测，对猪感染CSFV野毒或接种免疫弱毒疫苗不能进行鉴别诊断。哈兽研利用了能区分CSFV野毒和兔化弱毒的单克隆抗体，结合胶体金免疫层析技术，研制了能鉴别诊断CSFV野毒和兔化弱毒的胶体金免疫层析试纸条。

3.2 鉴别猪瘟病毒、牛腹泻病毒的实用技术

猪瘟病毒、牛腹泻病毒是同一类的病毒，它们感染症状相似，而且牛腹泻病毒引起的抗体会混淆、误导猪瘟的免疫，并且这些年来我们国家有些厂家的疫苗并不合格，主要是含有牛腹泻病毒。因此以牛病毒性腹泻病毒（BVDV）特异引物P1/P3扩增BVDV标准毒株及以猪瘟病毒（HCV）特异引物P2/P3扩增HCV阳性病料，分别扩增出326 bp和252 bp的特异片段；以P1、P2、P3扩增BVDV和HCV人工混合感染样品，扩增出大小为326 bp和252 bp的2条片段，建立特异的一步检测BVDV和HCV的复合PCR方法。以建立的复合PCR方法检测BVDV分离株，都扩增出1条326 bp的特异片段；从送检的病料和猪瘟兔化弱毒疫苗中扩增出252 bp的特异片段，从疑似猪瘟病猪的血清病料中，同时扩增出326 bp和252 bp的核酸片段，表明某猪场流行的“猪瘟”为BVDV和HCV混合感染。为进行HCV和BVDV的鉴别诊断与流行病学调查提供了有效的方法，特别是为鉴定合格的疫苗提供了技术手段。

3.3 快速确诊猪瘟病毒以及简单测定猪瘟抗体的的实用技术

可以使基层兽医在疫情暴发时在现场确诊，及早采取措施控制疾病的流行。如果能够在免疫以后能够随时确定抗体，在平时可以进行抗体追踪和随时监测，那将是十分方便的。正如刚才介绍的，胶体金可以实现这2个愿望。

3.3.1 当母猪分娩时，用抗体免疫金标试纸条检测母猪的抗体水平

如果在试纸条上只出现1条色带（C质控带），说明母猪体内的抗体滴度低于抵抗强毒攻击的最低保护抗体滴度，母猪应当及时进行疫苗接种，同时乳猪应当及时采用超前免疫，以免发生PRRS病。如果试纸条上出现2条色带，说明体内的抗体滴度较高，可以抵抗强毒的攻击，就不需要进行超前免疫，因为母猪可以通过初乳把抗体垂直带给仔猪。这时仔猪可以按照正常的免疫程序进行预防注射。

3.3.2 外购猪时，可用抗体免疫金标试纸条检测其是否免疫或免疫是否有效

为了防止CSFV发生，选择什么时间再进行CSFV免疫最合适，则可以根据不同地区，不同日龄的猪只，选择有代表性的猪只采血，应用猪CSFV抗体免疫金标试纸条进行快速检测，通过检测结果，可以了解整个猪群PRRS抗体的状况，从而决定是否及时开展免疫及选择适宜的免疫剂量，这样可以大大地避免PRRS的发生。

3.3.3 在怀疑发生CSFV时使用，可以采集病猪血液（血清）

用CSFV金标检测试纸检测，如果是发生CSFV时，猪体血液中没有CSFV抗体或抗体滴度很低。当然，发生CSFV而耐过不死的猪只，抗体滴度可能会很高。

3.3.4 在发生CSFV后使用

当发生CSFV时，常规的处理程序是全面隔离消毒和紧急预防注射。此时猪群特别是种猪场的猪群抗体滴度差异很大，当紧急预防注射后，抗体滴度又会出现明显的差异，因此，还应当了解猪群CSFV抗体水平，制定合理的免疫程序尤为重要。

4 问题与展望

迄今为止，人们对CSFV的研究始终没有停止过，CSFV的结构蛋白已经定位，但对非结构蛋白的定位、功能等研究还较少。对本病诊断方法的研究，由于近几年CSF的流行情况、临床症状等都发生了一些新的变化，以慢性、隐性感染为主，因此需要建立一种敏感性好、特异性强、快速方便的检测方法。许多的研究表明，该病毒与细小病毒和大肠杆菌病等同时发生混合感染在猪群中已经相当的普遍，要想根除本病，需要制定更为科学的防治方法。现在虽然很少发生CSF大流行，但在某些地区小范围内还会经常发生，而且近几年有上升的趋势，给全球养猪业带来了巨大的经济损失。我国作为一个养猪大国，时刻不能放松对CSF的研究，特别是国内关于分子生物学和基因工程方面的研究，这不仅对养猪业是严峻的考验，也给兽医科技工作者提出了紧迫和重大的课题。