姜燕华，段云裳，王丽鸳，周 健，曾建明，成 浩*

（1. 中国农业科学院茶叶研究所国家茶树改良中心，浙江 杭州 310008；2. 南京农业大学茶叶科学研究所，江苏 南京 210095）

福建省茶树栽培历史悠久，是我国茶树无性系品种的起源地。广大茶农在长期的生产实践中，筛选和培育了大批的无性系地方（农家）品种。这些地方品种中的部分优异者，如福鼎大白茶、政和大白茶、黄惔等在生产实际中的应用和分布较广，1985年被全国农作物品种审定委员会认定为第一批国家级良种，其中部分品种在20世纪60年代后被推广引种到全国各地的产茶省份，并成为各地茶树育种机构所经常采用的育种亲本。同时，近几十年来，福建省还采用单株选育、杂交等方法培育了福云系列、铁观音黄惔系列等一大批茶树良种，是我国茶树育成品种数较多的省份之一[1～5]。

分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。目前已经发展出多种标记方法，如RAPD、ISSR、SSR等，这些标记不仅在水稻[6]、小麦[7]等农作物上，还在马兰[8]、朱砂根[9]等药科植物上得到广泛应用。SSR（simple sequence repeats）标记又称微卫星（microsatellite）标记，是由1 ～ 6个核苷酸组成的简单重复序列，广泛分布于真核生物基因组中。SSR标记具备多态性丰富、重复性好、共显性和易于使用等特点，是目前应用最广的分子标记之一。在茶树物种研究中，多种分子标记都得到一定应用[10～11]，我国茶树 SSR标记的建立始于金基强等人[12]的研究。随后，茶树 SSR标记得到快速发展和广泛应用。姚明哲等[13]采用EST-SSR引物对我国江北茶区进行多态性和遗传结构分析，认为种质资源没有出现明显的地区分化；王丽鸳等[14]利用SSR标记对茶组资源间亲缘进化进行研究，构建出茶组12个种的遗传进化关系图；刘振等[15]通过EST-SSR标记对福建省茶树资源多态性进行研究，发现福建省茶树资源具有较高的遗传多样性；而黄建安等[16]将毛细管电泳四色荧光检测技术与SSR标记结合，使得SSR标记在茶树上的应用更为方便和可靠，且成本大大降低。但目前采用SSR标记来探讨人为选择对我国茶树品种多态性影响的系统分析还没有。

本文采用SSR分子标记方法，对福建省茶树地方品种和育成品种的亲缘关系和遗传结构进行了比较分析，并讨论人为选择对茶树品种遗传多态性的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

60份试验材料（表1）来源于中国农业科学院茶叶研究所国家茶树种质资源圃和福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃，包括31份地方品种（其中15份经国家或省级审（认）定）和29份近代育成品种（系）[5,17]。于4月下旬采集一芽二叶新梢，置－80℃冰箱中备用。

表1 参试茶树品种名称和来源Table 1 Name and origin of the tested 60 tea varieties

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 将材料于液氮条件下研磨成细粉，参照刘本英[18]CTAB法进行改进提取基因组DNA。1.0%的琼脂糖凝胶电泳定性检测所提DNA，用Shimadzu UV2550（日本津岛公司）分光光度仪定量检测纯度和浓度，最后将DNA浓度稀释标定到20 ng/μL，置于－20℃冰箱备用。

1.2.2 引物确定 引物由中国农业科学院茶树资源与改良中心自主开发，选取多态性较好的36对SSR引物用于本次实验标记，部分引物信息见表2及王丽鸳等人研究[19]。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。

表2 部分EST-SSR引物信息Table 2 Information of parts of EST-SSR primer pairs

1.2.3 PCR反应 PCR反应总体积10.0 μL，在PTC-200型PCR仪（MJ Research, Inc., Waltham, MA, USA）上进行，具体反应步骤为：94℃预变性4 min→35个循环的变性（94℃ 30s）→退火（温度随引物不同而不同，45s）→延伸（72℃ 30s）→72℃下继续延伸10 min→4℃保温[20]。

1.2.4 产物检测 采用 10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离检测，在 Bio-Rad 300型电泳仪（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）上电压设定为160 V，时间150 min，电泳结果用银染检测。用Bio-Rad Gel Doc 2000凝胶成像仪进行拍照记录。

1.3 数据统计与分析

对同一个SSR引物的扩增条带（等位变异）在各参试资源中记录有或无。同一位置条带如果无或模糊不易分辨，则记为“0”；如果有清晰条带，则记为“1”，用 Excel表存储，再按照各种不同的软件进行相应格式的转换。

参试资源某一位点的等位基因数（na）、有效等位基因数（ne）、期望杂合度（He）、Nei氏多样性指数（Nei）、平均遗传距离（Mean. D）以及Shannon信息指数（I）等数据统计在Popgene 1.32软件包中完成；基因型（GenoType）和多态性信息含量（PIC）在Powermarker Ver.3.25中完成；根据Nei氏遗传距离，按非加权类平均法（unweighted pair group method with arithmetic averaging, UPGMA），采用Popgene 1.32软件结合MEGA 3.1分析软件[21～22]对60份参试材料进行聚类并绘制聚类图。

采用structure2.3软件对60份供试材料进行遗传结构分析，按照似然值最大的原则选取合适的K值，得到基于模型的群体遗传结构图[23～24]。

2 结果与分析

2.1 参试材料的多态性分析

采用36对SSR引物对60份材料进行多态性分析，共检测到165条多态性条带，平均每对引物检测到4.58条（图1）；所得基因型共343个，平均为9.53个；平均多态信息量（PIC）0.54。

将参试材料分为基本未获推广应用的未审（认）定地方品种、品质性状优异而获得较大面积推广应用的审（认）定地方品种和现代育成品种3类，分别计算他们的多态性数据，并将生产上推广应用的审（认）定地方品种和现代育成品种合并作为一组，并计算了多态性各项数据。其结果（表 3）表明，前三组的多态性从高到低依次为未审（认）定地方品种＞育成品种＞审（认）定地方品种。而后两组合并成推广应用品种组后，其多态性结果仍低于未审（认）定地方品种组。但是，现代育成品种间的平均遗传距离却大于地方品种间的平均遗传距离。

图1 引物A58对60份福建茶树材料的扩增电泳图Figure 1 The amplification result of primer A58 for the 60 tea varieties from Fujian

2.2 参试材料的亲缘关系分析

由60份参试资源的聚类结果（图2）表明，在分支长度为 0.2883时，参试材料被划分为A1和A2两大类。

其中A1大类所聚的 15份供试材料全部属于未审（认）定的地方品种，如矮脚乌龙、腊面和张仪等；A2大类包括的是在生产中推广应用较多的国家（省）级审（认）定地方品种和现代育成品种，这一大类中还出现了4个聚集较为紧密的小亚群，其中B类主要为福鼎大白茶与云南大叶茶的杂交后代如福云6号、7号等，以及与福鼎有关的一些品种如福鼎大毫茶、早逢春、霞浦春波绿；D1类大部分是铁观音和黄棪的杂交后代如黄观音、黄玫瑰、紫玫瑰等，和铁观音同样来自于安溪的凤圆春，以及两个来自武夷山的品种九龙袍和丹桂；而D2类中大部分是原产于安溪县获国家级认定的地方品种，如毛蟹、铁观音、黄棪等。

60份供试材料中遗传距离最大的是大红和红芽佛手，都属于地方品种，为1.87。而黄玫瑰和紫玫瑰由于遗传背景非常接近[25]，他们之间的遗传距离最小，只有0.02。

图2 60份茶树材料的UPGMA聚类图Figure 2 Dendrogram of PopGen cluster

2.3 参试材料的遗传结构分析

遗传结构分析显示，当K = 2时，能够取到最大似然值，此时供试材料被分为两大类群：I亚群和Ⅱ亚群（图3），两大亚群分离明显，具有明显的结构差异。

其中第I亚群包括15份供试材料，占总参试材料的25%，全部为未审（认）定地方品种，与聚类分析结果中的A1类完全一致；剩下的45份参试资源分布于亚群Ⅱ，占总数的75%。

图3 60份材料的遗传结构Figure 3 The genetic structure of 60 tea germplasms from Fujian

3 讨论

本文采用的聚类分析和遗传结构分析都将60份参试材料以相同的方式分成了两大类，第一大类囊括了15个未经审定的地方品种，这些品种资源的共同特点是在生产实践上获得的认可度较低，因而没有获得规模化的推广应用。而另一大类则包括了在生产中获得了较大规模推广应用的、已经获得国家或省级审（认）定的地方品种和其他所有的现代育成品种，这些品种的共同特点是其品质性状都较为符合近现代茶叶生产的需求，获得茶叶生产经营者认同度较高。因此，这样两种来源的品种被归入同一大类的原因之一，可能就在于他们都是经历了较为强烈的人为筛选后所留下的幸运儿，而这些人为筛选的目标或者标准，因为都是以生产实际为指导的，因而是基本相同或近似的，由此导致了他们在较多的性状位点上趋于同质化。这两类品种材料的多态性指标数值低于未经审（认）定地方品种组的事实，同样表明了他们遗传多样性程度的被降低。

表3 不同类型品种的多态性比较Table 3 Polymorphic comparison among different groups

审（认）定地方品种和现代育成品种被归入同一大类的另一个影响因素可能来自于以下事实，在29个育成品种中，多数（19个）都与福鼎大白茶、铁观音和黄惔这三个地方品种中的一个或两个有亲缘关系，它们或者是这三个地方品种的杂交后代，或者是从这三个地方的种子后代中筛选出来的，因而使得这两类材料间的遗传背景变得更为相近。但是，另一方面，来自于云南的云南大叶茶作为杂交亲本的引入，可能是导致育成品种间平均遗传距离增大的原因。因此，从以上分析可以看出，带有相同或相似目的的人为选择，确实降低了生产上推广使用的茶树品种的遗传多样性。

致谢：在研究过程中得到了福建省茶叶研究所郭吉春研究员的大力帮助，在此谨表谢意。

[1]叶乃兴，郭吉春. 福建茶树品种资源的研究现状与展望[J]. 福建茶叶，1997（1）：42－45.

[2]叶乃兴，杨如兴，郭吉春，等. 福建茶树遗传资源的多样性和品种创新[J]. 福建农林大学学报（自然科学版），2004，33（2）：174－177.

[3]陈宗懋. 中国茶叶大辞典[M]. 北京：中国轻工业出版社，2008.

[4]杜起洪. 福建省茶树良种优势面临的新问题[J]. 福建茶叶，1999（2）：35－37.

[5]中国茶树品种志编写委员会. 中国茶树品种志[M]. 上海：上海科学技术出版社. 2001.

[6]张晓丽，郭辉，王海岗，等. 中国普通野生稻与栽培稻种SSR多样性的比较分析[J]. 作物学报，2008，34（4）：591－597.

[7]沈裕琥，窦全文，王海庆，等. SSR水平上甘、青两省春小麦品种间的遗传多样性现状及演变趋势[J]. 西北植物学，2003，23（10）：1755－1761.

[8]叶荣华，刘跃钧，斯金平，等. 马兰种质遗传多样性的研究[J]. 浙江林业科技，2008，28（3）：39－42.

[9]袁德义，何小勇，莫文娟，等. 朱砂根ISSR反应体系的建立与优化[J]. 浙江林业科技，2008，28（4）：60－62.

[10]王丽鸳，成浩，周健. 茶树DNA分子标记及基因工程研究进展[J]. 茶叶科学，2004，24（1）：12－17.

[11]刘本英，王丽鸳，周健，等. 云南大叶种茶树种质资源ISSR指纹图谱构建及遗传多样性分析[J]. 植物遗传资源学报，2008，9（4）：458－464.

[12]金基强，崔海瑞，陈文岳，等. 茶树EST-SSR的信息分析与标记建立[J]. 茶叶科学，2006，26（1）：17－23.

[13]姚明哲，刘振，陈亮，等. 利用EST-SSR分析江北茶区茶树资源的遗传多样性和遗传结构[J]. 茶叶科学，2009，29（3）：243－250.

[14]王丽鸳，刘本英，姜燕华，等. 用SSR分子标记研究茶组植物种间亲缘进化关系[J]. 茶叶科学，2009，29（5）：341－346.

[15]刘振，姚明哲，王新超，等. 基于EST-SSR的福建地区茶树资源遗传多样性和亲缘关系分析[J]. 中国农业科学，2009，42（5）：1720－1727.

[16]黄建安，李娟，谭月萍，等. 毛细管电泳四色荧光检测法分析茶树SSR标记[J]. 生命科学研究，2009，13（3）：251－257.

[17]江用文. 国家种质资源圃保存资源名录[M]. 北京：中国农业科学技术出版社. 2005. 711－781.

[18]刘本英，王平盛，周红杰，等. 云南茶组植物ISSR-PCR反应体系的建立[J]. 云南农业大学学报，2006，21（增）：21－25.

[19]王丽鸳，姜燕华，段云裳，等. 茶树EST-SSR分布特征及引物开发[J]. 植物遗传资源学报，2009，10（4）：511－516.

[20]刘振，王新超，赵丽萍，等. 基于EST-SSR的西南地区茶树资源遗传多样性和亲缘关系分析[J]. 分子植物育种，2008，6（1）：100－110.

[21]Kumar S，Tamura K，Nei M. MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment[J]. Brief Bioinfor，2004，5（2）：150－163.

[22]Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals[J]. Genetics，1978（89）：583－590.

[23]张军，赵团结，盖钧镒. 中国东北大豆育成品种遗传多样性和群体遗传结构分析[J]. 作物学报，2008，34（9）：1529－1536.

[24]Pritchard J K，Stephens M，Donnelly P. Inference of population structure using multilocus genotype data[J]. Genetics，2000（155）：945－959.

[25]叶乃兴. 我国茶树育种的骨干亲本及其系谱分析[J]. 中国茶叶，2008（4）：11－13.