危晓莉 王 媚 潘佩蕾 陈丽芬 (浙江大学医学院,杭州310058)

许多中药及中药复方可诱导细胞产生细胞因子或具有细胞因子样作用,且能增加免疫细胞活性,故可用于肿瘤的生物治疗。本课题研究了小檗碱(Berberine,Ber)对外周血来源DC和CIK增殖和杀HepG-2活性的影响,探讨小檗碱应用于肿瘤过继免疫治疗的潜能。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 CD3McAb(美国eBioscience公司);rhIL-1β、rhIL-2、rhIL-4、rhGM-CSF 、rhIFN-γ(美国 PEPROTECH公司);MTT、小檗碱(美国Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 制备HepG-2肿瘤细胞冻融物抗原 消化、收集对数生长期的HepG-2细胞,PBS调整浓度为4×107ml-1,反复冻融3次,离心取上清,过滤除菌,-20℃保存备用。

1.2.2 人外周血来源DC的诱导培养 Ficoll密度梯度离心法分离无菌肝素抗凝外周血单个核细胞(PBMC),细胞培养板孵育2小时后,悬浮细胞诱导扩增CIK,贴壁的单核细胞诱导生成DC,DC培养液中rhIL-4(500 U/ml)、rhGM-CSF(1 000 U/ml)。48小时后DC分为两组,一组加入小檗碱3μmol/L,另一组为阴性对照组,继续培养72小时后,两组均加入HepG-2肿瘤细胞冻融物抗原20μg/ml。

1.2.3 IL-12检测 培养第8天收集两组DC上清,ELISA法检测IL-12水平。

1.2.4 CIK体外诱导扩增 上述悬浮细胞加入IFN-γ1 000 U/ml,37℃,5%CO2培养24小时后加入IL-1 10U/ml、CD3McAb 50 ng/ml、IL-2 300U/m1,每 3天半量换液1次。

1.2.5 DC和CIK共培养 第8天分别收集两组DC和CIK,计数并调整其浓度,按DC∶CIK 为1∶5和1∶10混合共培养,每3天补充IL-2 300 U/ml,第15天收集各组细胞并计数。

1.2.6 DC-CIK对HepG-2杀伤活性检测 收集培养第15天各组DC-CIK共培养细胞作为效应细胞,收集对数生长期HepG-2肝癌细胞作为靶细胞,按DC-CIK 与HepG-2效靶比分别为5∶1,10∶1,20∶1混合,另设DC-CIK效应细胞对照和HepG-2靶细胞对照,均设3个复孔,37℃,5%CO2孵育12小时,MTT法检测各孔OD值并计算杀伤率,杀伤率(%)=[1-

1.3 统计学处理 使用Stata7.0软件,进行自身配对t检验及方差分析,P＜0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 DC的形态学观察 培养第8天,镜下观察小檗碱组DC较阴性对照组DC长势好,大部分细胞悬浮不贴壁,聚集成簇,为细胞集落,平均每个视野细胞集落明显多且大,细胞胞体较大,见毛刺状突起,形态不规则。

2.2 小檗碱对DC、DC-CIK细胞增殖能力的影响血球计数板直接计数培养第8天小檗碱组与阴性对照组DC,结果显示:小檗碱组DC较阴性对照组明显增多,P＜0.01,差异具有统计学意义;DC与CIK细胞共培养24小时见DC与较多CIK细胞聚集成团,培养第15天见DC-CIK细胞群增殖迅速,成团块状生长,大小均一。两组 DC-CIK计数结果显示:DC∶CIK=1∶5时,小檗碱组DC-CIK 增殖能力明显高于阴性对照组,P＜0.05,差异具有统计学意义,DC∶CIK=1∶10时,小檗碱组DC-CIK增殖能力高于阴性对照组,但P＞0.05,差异无统计学意义(表1)。

2.3 小檗碱对DC产生IL-12能力的影响 DC培养上清中IL-12含量小檗碱组为27.37±8.09 pg/ml,阴性对照组为30.83±11.24 pg/ml,两组相比 P＞0.05,差异无统计学意义。

2.4 小檗碱组和阴性对照组DC-CIK对HepG-2杀伤活性的比较 当DC与CIK同一混合比例,DCCIK与HepG-2同一效靶比时,小檗碱组和阴性对照组的杀伤率比较P＞0.05;当DC与CIK不同混合比例而DC-CIK与HepG-2同一效靶比时,小檗碱组和阴性对照组的杀伤率比较P＞0.05,差异均无统计学意义;每组组内随着效靶比的增高杀伤率增高,其中DC∶CIK为1∶5时小檗碱组杀伤率和DC∶CIK为1∶10时阴性对照组杀伤率组内比较P＜0.05,差异有统计学意义,其差异均主要是来自于效靶比为5∶1和20∶1时的差异(表2)。

表1 小檗碱组与阴性对照组的 DC和CIK增殖能力的比较(105/ml,±s,n=12)Tab.1 The comparison of DC and CIK proliferation between Berberine group and negative control group(105/ml, ±s,n=12)

表1 小檗碱组与阴性对照组的 DC和CIK增殖能力的比较(105/ml,±s,n=12)Tab.1 The comparison of DC and CIK proliferation between Berberine group and negative control group(105/ml, ±s,n=12)

Note:1)Compared with negative control group P＜0.01;2)Comparedwith negative control group P＜0.05.

Groups DC DC-CIK DC∶CIK=1∶5 DC∶CIK=1∶10 Berberine group 3.785±2.0961) 8.142±2.9092) 12.358±6.367 Negative control group 2.684±1.496 5.900±1.96 9.375±2.420

表2 小檗碱组和阴性对照组 DC-CIK对 HepG-2的杀伤活性及比较(%,±s,n=9)Tab.2 The comparison of killing Hep G-2 activity of DC-CIK between Berberine group and negative control group(%,±s,n=9)

表2 小檗碱组和阴性对照组 DC-CIK对 HepG-2的杀伤活性及比较(%,±s,n=9)Tab.2 The comparison of killing Hep G-2 activity of DC-CIK between Berberine group and negative control group(%,±s,n=9)

Note:1)As the ratio of DC∶CIK is 1∶5,the killing rateis compared among the Berberinegroup,P ＜0.05;2)As the ratio of DC∶CIK is 1∶10,the killing rate is compared among the negative control group,P＜0.05.

Groups DC∶CIK=1∶5DC∶CIK=1∶10 5∶1 10∶1 20∶15∶1 10∶1 20∶1 Berberine Group 63.0±11.91) 70.4±11.8 80.9±9.1 62.8±10.1 72.2±11.8 73.9±8.3 Negative Control group 68.8±11.0 69.0±12.0 72.8±10.9 65.7±5.82) 73.4±10.4 78.5±9.3

3 讨论

DC联合CIK治疗肿瘤在体内外试验中均显示出强大的杀伤活性和众多的优势[1,2],但其突出的缺点是成本高,特别是制备所需的细胞因子价格昂贵,极大的限制了其临床应用率。有些学者将注意力转向外源性物质诱导内源性细胞因子产生,进而取代输入外来重组品的思路上来。实验与临床研究证实,许多中药及中药复方可诱导细胞产生细胞因子或具有细胞因子样作用,可减少细胞因子用量,且能增加免疫细胞活性,故对于肿瘤的治疗,包括直接的抗肿瘤治疗和过继免疫治疗都是十分有利的[3-5]。小檗碱是一味古老抗菌药,近年来研究发现其对一些肿瘤有直接抗肿瘤作用[6],其是否具有间接抗肿瘤作用呢?Kang等[7]实验证明小檗碱可以增加LPS激活的巨噬细胞IL-12、IFN-γ表达,可抑制抗原刺激的CD4+T细胞分泌IL-4,且使CD4+T细胞偏离Th2而向Th1分化,这为小檗碱用于抗微生物和抗肿瘤作用提供了新的解释。本实验中,培养7天后小檗碱组细胞数比阴性对照组高出1.5倍左右,形态更成熟,DC与CIK共培养时,小檗碱组DC-CIK细胞比阴性对照组多,说明小檗碱能促进DC的增殖,能增强DC刺激淋巴细胞增殖的能力。而DC分泌IL-12水平两组没有明显差别,说明小檗碱促进淋巴细胞增殖的能力不是通过提高IL-12分泌水平来实现的 ,当然是否通过促进 DC 分泌 IFN-γ、IL-1、IL-2,即CIK诱导细胞因子,来促进CIK的增殖还有待进一步研究。小檗碱对DC-CIK杀HepG-2活性无明显影响,表明小檗碱不影响DC-CIK杀伤肿瘤细胞的能力。综上所述,小檗碱能促进DC和DC-CIK的增殖,对DC-CIK单细胞杀肿瘤活性没有影响,其促进DC和DC-CIK增殖的机制可能是因为小檗碱具有类细胞因子的作用,但也可能有其他作用机制的影响,还有待于进一步的研究。鉴于本实验结果我们可初步认为小檗碱有可能用于临床DC-CIK的过继免疫治疗,对降低CIK的制备成本,提高DC-CIK临床应用率有重要意义。

1 Angena M,Sabing R,Marie LT et al.Enhanced lysis activity of cytokine induced killer cells against multiple myeloma cells after co-culture with idiotype-pulsed dendritic cells[J].Haematologica,2001;86(10):1029-1037.

2 王新帅,祁岩超,王远东 et al.脐血来源树突状细胞增强CIK细胞对肺癌细胞株的杀伤作用[J].国际医药卫生导报,2005;11(18):18-20.

3 朱京元.T淋巴细胞转化和LAK细胞制备中五种中药效用的实验观察[J].临床输血与检验,2001;3(3):6-8.

4 王 光,周正任,娄 丹 et al.黄芪多糖对IL-2/LAK抗肿瘤增强作用的动物实验研究[J].中国免疫学杂志,1994;10(6):359-361.

5 李金锋,黄信孚,林本耀.猪苓多糖对小鼠NK、LAK活性的影响[J].中华微生物学和免疫学杂志,1995;15(2):89-91.

6 刘 泽,蔡少平.小檗碱抑制结肠癌细胞中COX-2表达作用的研究[J].中国新药杂志,2004;13(9):796-799.

7 Kang BY,Chung SW,Cho D et al.Involvement of p38mitogen-activated protein kinase in the induction of interleukin-12 p40 production in mouse macrophages by berberine,a benzodioxoloquinolizinealkaloid[J].Biochem Pharimacol,2002;63(10):1901-1910.