周珠哈,王 安,吴 乐,朱珊丽,朱冠保,张丽芳

人类表皮生长因子受体2(HER2/neu)是一种原癌基因,定位于染色体 17q21,编码一个 185 kDa的跨膜受体酪氨酸激酶,也称为 p185[1],是表皮生长因子受体 (EGFR)家族的第二成员,HER2/neu自身可形成同源二聚体或与 EGFR其他成员形成异源二聚体,继而发生磷酸化,激活其胞内酪氨酸激酶,将细胞生长信号和其他相关信号持续地传导给细胞,最终导致细胞的增殖、癌变、对化疗药物耐受等一系列生物学性状的改变[2]。HER2/neu基因的扩增或过度表达见于许多上皮源性肿瘤中,如原发性浸润性乳腺癌 (25% ～30%)、胃癌(10%～20%),其表达程度与肿瘤的临床分期及预后密切相关[3-4],是不良预后的独立预测因子[5-6]。曲佐单抗 (herceptin)是人源化的 HER2/neu靶向单克隆抗体,在 HER2/neu过表达的乳腺癌及胃癌患者的临床治疗中取得了显著疗效[7-8]。使 HER2/neu成为理想的抗肿瘤免疫治疗的靶标。B细胞表位是抗原中可被 B细胞抗原受体或抗体特异性识别并结合的线性片段或空间构象结构。对 B细胞表位进行准确预测,不仅有助于肿瘤基础免疫学研究,而且对肿瘤疫苗和抗体的研究与开发、诊断与治疗均具有重要意义。本研究利用生物信息软件系统及相关抗原性指数等,预测分析了 HER2/neu的二级结构及其 B细胞优势表位,为 HER2/neu单克隆抗体的制备和基因工程疫苗的设计和研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 HER2/neu氨基酸序列:HER2/neu完整蛋白质的氨基酸序列检索自 Swiss Prot蛋白质数据库。

1.2 方法 HER2/neu二级结构预测:采用 EXPASY服务器提供的 SOPMA、GOR、HNN方法预测。HER2/neu跨膜区域预测:采用 EXPASY服务器提供的 SOSUI方法。HER2/neu亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测:采用EXPASY服务器提供的 Hopp＆ Woods、Zimmerman方法和DNAstar软件的 Protean进行 Emini和 Jameson-Wolf分析。对上述方法预测的结果进行综合分析,兼顾各预测参数推断HER2/neu的 B细胞表位,并用吴玉章等[9]建立的抗原性指数综合评判 HER2/neu的 B细胞优势表位。

2 结果

2.1 HER2/neu的氨基酸序列 取自 Swiss Prot蛋白质数据库(编号:P04626),共 1 255个氨基酸,相对分子质量 137 910 Da。

2.2 HER2/neu的二级结构预测 分别应用 EXPASY服务器上的 GOR、HNN、SOPMA方法预测 HER2/neu的二级结构。选取标准:3种方案中,取至少有两个方案预测结果一致的重叠区为准。无规则卷曲主要位于 N端的 16～22,26～40,55～70,117～137,157～165,186～215,220～251,258～270,274～288,298～302,305～310,315～321,324～339,377～394,414～421,446～451,497～504,509～539,556～572,579～584,590～595,599～613,617～652,696～707,727～731,741～747,756～764,813～819,854～858,900～904,918～927,938～947,962～967,991～1 001,1 010～1 015,1 026～1 042,1 046～1 059,1 062～1 084,1 087～1 180,1 187～1 219,1 223～1 255区段,它们可维持HER2/neu分子结构的稳定。HER2/neu二级结构中柔性区域以无规则卷曲为主,少见 β-转角。用 Kruskal-Wallis H Test检验 3种方法预测对 HER2/neu二级结构中的 α-螺旋、β-片层、无规则卷曲和 β-转角的构成比的差别,结果表明 3种方法对 HER2/neu二级结构的预测分析结果间差异无统计学意义 (P=0.995,见表 1)。

2.3 HER2/neu跨膜区域预测 经 SOSUI方法分析,HER2/neu为具有 2次跨膜螺旋的膜蛋白,分别为 1～23,652～674区段,膜外区域位于 N端 24～651区段,膜内区域位于 N端675～1 255(见表 2,图 1)。

表 1 GOR4、HNN、SOPMA 3种方法预测 HER2/neu二级结构的构成比 〔n(%)〕Table 1 Constitution ratio of HER2/neu secondary structure predicted by GOR4,HNN and SOPMA

表 2 SOSUI方法预测 HER2/neu跨膜区域Table 2 Transmembrane structure of HER2/neu predicted by SOSUI

图 1 SOSUI方法预测 HER2/neu跨膜区域Figur e 1 Transmembrane structure of HER2/neu predicted by SOSUI

2.4 HER2/neu蛋白的亲水性、表面可及性、抗原性、极性及柔韧性参数预测 综合各参数分析 HER2的 B细胞表位所在的优势区段:30～38,117～124,186～195,224～237,245～251,281～288,324～339,380～388,456～465,497～504,601～606,617～623,633～652,939～943,992～997,1 049～1 057,1 106～1 116,1 121～1 126,1 140～1158,1 166～1 175,1 225～1 234,1 240～1 246(见图 2、表 3)。

图 2 各种不同参数对 HER2/neu的预测结果Figure 2 Prediction of HER2/neu with various parameters

表 3 不同方法预测 HER2/neu二级结构区域结果Table 3 Epitopes predicted by various methods

2.5 HER2/neu抗原表位的综合分析 综合以上预测结果,根据吴玉章等[10]的抗原性指数计算方法,计算 HER2/neu可能的 B细胞表位区段平均抗原性指数,结果显示 HER2/neu N端:497～504,939～943,1 106～1 116,1 140～1 158,1 166～1 175,1 225～1 234,1 240～1 246区段的抗原性指数相对较高 (见表 4),可能为 HER2/neu肿瘤抗原的优势 B细胞表位。

表 4 HER2/neu的 B细胞表位优势区域的平均抗原性指数Table 4 Average antigenicity index of epitopes

3 讨论

在免疫应答过程中,B细胞表位供 B细胞受体 (BCR)识别诱导抗体应答,合理设计表位疫苗可以增强特异的保护性免疫反应的强度,避免常规抗原结构中可能出现的非必要的、抑制性表位的作用,以减少疫苗的不良反应。利用生物信息学的技术方法,对目的蛋白质的优势抗原表位进行预测分析,可预先对表位疫苗进行设计以减少研究的盲目性。

B细胞表位在结构上可分为连续性的线性表位和不连续的空间构象表位。构象表位是蛋白质的二级或三级结构,不太稳定,在蛋白质受热或酶解变性后会彻底破坏,不能恢复,分离和研究比较困难,因此目前大多数 B细胞表位预测方法是预测由连续的氨基酸残基构成的线性 B细胞表位。

预测 B细胞表位主要的参数有二级结构、亲水性、表面可及性、抗原性以及柔韧性等。虽然亲水性和可及性是形成表位的首要条件,但决定表位是否具有抗原性尚需多种因素的参与,因而表位的形成是多种因素综合作用的结果。蛋白质序列中肽链的局部可及性或柔韧性与相应部位的抗原性也密切相关。蛋白质的二级结构对抗原表位有很大影响。α-螺旋、β-折叠的化学键键能比较高,能够较牢固地维持蛋白质的高级结构,但很难合适地与抗体嵌合,且经常处于蛋白质的内部,因而很少能成为抗原表位所在区域。而 β-转角及无规则卷曲等柔性结构比较松散,易于发生扭曲、盘旋,并展示在蛋白质的表面,成为抗原表位的可能性较大。

吴玉章等[10]综合考虑蛋白质的多种性质,如片段的活动性、结构、构象和氨基酸侧链的排列等,建立了抗原性指数预测方法,用以筛选 B细胞优势表位。发现 B细胞表位中 Leu、Thr、Pro、Asp、Asn、Glu、His、Lys、 Arg比一般蛋白质中常见 ;Gly、Ala、Val、Ile、Cys、 Met、Gln、Phe、 Tyr、Trp正相反,Ser则与一般蛋白质中的发现频率相等。这种氨基酸组成上的差异可能与蛋白质的抗原性有关,亲水性残基更易出现在蛋白质表面,因此,某些氨基酸残基在表位中出现的频率更高,其抗原性指数就更大。

本研究通过对二级结构、跨膜区、亲水性、表面可及性与抗原性等多种参数的综合比较分析,预测了 HER2/neu可能的B细胞优势表位,为该蛋白表位疫苗设计及单克隆抗体的制备等研究提供了理论依据。

1 Coussens L,Yang-Feng TL,Liao YC,et al.Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene[J].Science,1985,230:1132-1139.

2 Meric-Bernstam F,Hung MC.Advancesin targeting human epidermal growth factor receptor-2 signaling for cancer therapy[J].Clin Cancer Res,2006,12:6326-6330.

3 Slamon DJ,Clark GM,Wong SG,et al.Human breast cancer:correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene[J].Science,1987,235:177-182.

4 Barros-Silva JD,Leitao D,Afonso L,et al.Association of ERBB2 gene status with histopathological parameters and disease-specific survival in gastric carcinomapatients[J].Br JCancer,2009,100:487-493.

5 Ravdin PM,Chamness GC.The c-erbB-2 proto-oncogene as a prognostic and predictive marker in breast cancer:aparadigm for the development of other macromolecular markers— — a review[J].Gene,1995,159:19-27.

6 Gravalos C,Jimeno A.HER2 in gastric cancer:a new prognostic factor and a novel therapeutic target[J].Annals of Oncology,2008,19:1523-1529.

7 Vogel CL,Cobleigh MA,Tripathy D,et al.Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer[J].J Clin Oncol,2002,20:719-726.

8 Van Cutsem E,Kang Y,Chung H,et al.Efficacy resultsfrom the To GA trial:A phaseⅢstudy of trastuzumab added to standard chemotherapy(CT)in first-line human epidermal growth factor receptor 2(HER2)-positive advanced gastric cancer(GC)[J].J Clin Oncol,2009,27(18S):LBA4509.

9 吴玉章,朱锡华.一种病毒蛋白细胞表位预测方法的建立 [J].科学通报,1994,39:2275-2279.

10 吴玉章,朱锡华 .蛋白质抗原表位的研究 [J].科学,1994,(1):93.