郭 来 王再谟

肝纤维化（HF）是一切慢性肝病共同的病理学特征，也是病情进一步向肝硬化发展的主要环节。能否将病变终止于HF或逆转至正常，是治疗各种慢性肝病的关键，也是影响疗效和死亡率的重要因素。近年来的研究提示，HF在进入肝硬化之前，过度沉积的细胞外间质（ECM）是可以逆转的。肝心宁胶囊经临床验证，对HF及早期肝硬化确有一定的疗效，为了进一步探讨其作用机理，笔者进行了一系列实验研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 （1）动物：SD雄性大鼠83只，体质量（200g±10）g，一级动物，由四川省抗生素研究所提供，检验后备用。（2）试剂：液体双试剂（上海科学东菱试剂厂提供）；37% ～40%甲醛（重庆东方试剂厂提供，分析纯，批号：950938）；CCI4（郑州化学试剂二厂提供，分析纯，批号：95048）；无水乙醇（安徽特级酒精总厂提供，分析纯，批号：950879）。（3）仪器：法国 S-500P 半自动生化分析仪；ACE919型全自动生化分析仪（日本尼泰克公司生产）；721型分光光度计（四川分析仪器厂生产）；电子天平（上海第二天平仪器厂生产）；LZT1台式电动离心机；JEM-100SX电镜（日本电子公司）。（4）药剂：秋水仙碱（匈牙利Laboratoyes公司产品，批号：95910）用蒸馏水配制成16.7ug/mL溶液置4℃冰箱中备用。大黄蜇虫丸（中国广东阳江制药厂产品，批号：961113）用蒸馏水配制成0.2g/mL悬浊液置4℃冰箱中备用。肝心宁胶囊：由丹参、茵陈、连翘、肉桂、制何首乌、女贞子、五味子等制成半浸膏装胶囊内（广汉市中医药研究所研制，批号：970304）。将肝心宁流浸膏配成混悬液，其中肝心宁高剂量组质量浓度为0.19g/mL；肝心宁低剂量组质量浓度为0.095g/mL；分别相当于生药2.5、1.5g/mL。

1.2 方法 （1）分组：将83只大鼠按完全随机方法分为6组，即正常组8只，模型组、秋水仙碱组、大黄蜇虫丸组、肝心宁高剂量组、肝心宁低剂量各15只。自由摄食全价颗粒饲料，饮水驯化喂养1周后使用。在实验过程中均开架分笼饲养，每笼5只，自然光照，并定期清洁、消毒。（2）动物模型制作：大鼠在实验室喂养1周后开始实验。实验第1日按0.5mL/100g体质量皮下注射的40%CCl4橄榄油，以后每隔3d（或4d）按0.3mL/100g体质量皮下注射40%CCI4橄榄油，共13次。在整个实验过程中，正常组大鼠饲以全价饲料，自由饮自来水，其余各组均以饲料配方1（79%纯玉米粉+20%猪油+0.5%胆固醇压制成颗粒饲料）喂养2周，继之以饲料配方2（89.5%纯玉米粉+10%猪油+0.5%胆固醇混合物压制成颗粒饲料）喂养至6周末，另外以30%乙醇为饮料饲养动物。（3）给药及取标本方法：从实验第2日开始定时灌胃，每日1次，每次给药剂量为：肝心宁高剂量组1mL/100g体质量（0.19g/mL，相当于临床用量的20倍）；肝心宁低剂量组1mL/100g体质量（0.095g/mL，相当于临床用量的10倍）；秋水仙碱组1mL/100g体质量（16.79/mL，相当于临床用量的10倍）；大黄蜇虫丸组1mL/100g体质量（0.2g/mL相当于临床用量的10倍）；正常组、模型组给予1mL/100g体质量蒸馏水，灌胃前先将药液静置到室温，摇匀，再根据不同体重给药，共给药42d，末次给药24h后行乙醚麻醉，剖腹，取肝脏待测。

1.3 观察指标及方法 （1）光镜：试验结束时，取肝脏左叶标本以10%甲醛固定，石蜡包埋，梯度脱水，常规脱蜡，切片，HE染色作光镜检查。（2）电镜：取0.1cm3肝组织标本经3%戊二醛及1%锇酸双固定，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀、枸橼酸铅双重电子染色。使用日本电子公司JEM-100SX型透射电镜观察。

2 结果

2.1 光镜 （1）正常组：肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，核圆形，含有小叶间动脉、门静脉和胆小管，无炎细胞浸润。（2）模型组：均可检出不同程度的纤维增生，由汇管区，小叶间进一步伸入并分割肝小叶。汇管区、肝窦周围可见多形核白细胞、淋巴细胞等炎细胞浸润，多数胞质内有大量脂滴，少数肝细胞质疏松和肿胀，发生气球样变性。（3）秋水仙碱组：可见较多的炎细胞浸润，但纤维组织增生较模型组明显减轻。（4）大黄蜇虫丸组：肝细胞排列较规整，胶原纤维明显减轻，无假小叶形成，肝细胞数目增多。（5）肝心宁低剂量组：与模型组比较，肝细胞排列较规整，偶见肝小叶点状坏死灶，伴有少量淋巴细胞浸润。（6）肝心宁高剂量组：肝小叶间有少量纤维组织增生，个别肝细胞气球样变，汇管区有少量淋巴细胞浸润。

2.2 电镜 见图1～图6。（1）正常组：肝细胞形态正常，肝细胞呈卵圆形，核仁清楚，肝细胞连接较紧密，细胞间通道有微绒毛，胞质内有丰富的线粒体，细胞核周围有分布规律的粗面内质网，线粒体周围有高尔基复合体。（2）模型组：肝细胞结构紊乱，胞间微绒毛消失，肝细胞之间有胶原纤维增生，核缩小，胞核内脂肪滴分布多量，线粒体肿胀。（3）秋山仙碱组：肝细胞间胶原纤维增生略有好转，内质网分布紊乱无规律，胞质内脂滴减少，胞浆内溶酶体可见。（4）大黄蜇虫丸组：核内染色体较模型组增多，内质网分布较规律，胞浆内有少量的脂滴。（5）肝心宁低剂量组：肝细胞间胶原纤维增生明显减轻，线粒体肿胀好转，胞浆内脂滴明显减少，糖原颗粒较多。（6）肝心宁高剂量组：肝细胞形态大致正常，胶原纤维少见，线粒体数目增多，高尔基体典型分布规律，糖原颗粒数目增多。

3 讨论

图1 正常组（EM×12800）

图2 模型组（EM×12800）

图3 秋水仙碱组（EM×12800）

图4 大黄蜇虫丸组（EM×12800）

图5 肝心宁低剂量组（EM×12800）

图6 肝心宁高剂量组（EM×12800）

肝纤维化是指肝组织内ECM成分过度增生与异常沉积，导致肝脏结构或功能异常的病理变化[1]。是各种慢性肝病共有的病理特征，也是发展到肝硬化的必经阶段，大量研究表明，肌纤维化有逆转的可能[2]。肌纤维化形成原因主要与病毒在肝细胞内持续复制和免疫功能失调有关。病毒不能及时被清除而不断感染健康的肝细胞，并激活免疫机制，使肝细胞受损范围不断扩大，病情进行性加重，使肝内有过多的胶原沉积，纤维增生，肝小叶结构被破坏[3]。肝纤维化发生最常见的原因为慢性病毒性肝炎，其次为与酒精和肥胖相关的脂肪性肝炎、血吸虫肝病、药物性肝病、自身免疫性肝病、新生儿肝病、代谢性肝病等[4]。

肝纤维化属于中医学“积聚”、“鼓胀”范畴。传统多认为“血瘀”为其基本病机，治疗多从活血化瘀入手，但疗效并非尽如人意。现今临床多认为，正虚邪实、虚痰瘀毒是本病的主要特点，肝郁脾虚、痰瘀阻滞是本病的主要病机[5]。

本研究显示，模型组出现肝细胞肿胀，不同程度纤维组织增生，并分割肝小叶，同时汇管区及肝窦周围有白细胞、淋巴细胞浸润，少数肝细胞肿胀，发生气球样变。肝心宁低剂量及肝心宁高剂量组上述情况明显减轻。电镜观察，模型组出现线粒体肿胀，内质网分布不规律，糖原颗粒减少，胶原纤维大量增生，并分割肝细胞，胞浆内有大量脂滴。肝心宁低剂量及肝心宁高剂量组上述情况明显减轻。

我们采用复合因素造模方法，即用CCl4皮下注射，在饲料中混以猪油、胆固醇，并以30%乙醇为饮料。本模型42d左右即可形成，与大多数肝纤维化相似，具有周期短，死亡率低，模型成功率高等优点[6]。

肝心宁胶囊尊崇张仲景《金匮要略》五味治肝的学术思想：即“夫肝之病，补用酸，助用焦苦，益用甘味之药调之。”此仲景肝病用药的五味规律。本方中酸味药为五味子，苦味药丹参、茵陈，甘味药为制何首乌、女贞子、甘草等。酸能补肝，故补用酸。心为肝之子，子能令母实，故助用焦苦。甘能缓急，又能和中，故以甘味之药调之。稍佐肉桂芳香走串，以加强活血化瘀作用，具补虚不伤正、扶正不恋邪、攻补兼施之功效。

本方有良好的保护肝细胞，清除脂滴，调节脂质代谢，保护肝细胞器，清除氧自由基作用。其机理可能与肝心宁胶囊及其有效成分抑制脂质过氧化，减轻脂质过氧化对生物膜系统的损伤，减轻氧自由基对细胞器的损害有关。

[1]中国中西医结合学会肝病专业委员会.肝纤维化中西医结合诊疗指南[J]. 中国中西医结合杂志，2006，26（11）：1052 ～ 1056.

[2]刘燕玲，李志更，郭朋.以活血化瘀为核心治疗肝纤维化的思路[J]. 中医杂志，2009，50（1）：76 ～ 81.

[3]许青云，燕兰英，熊汉申，等.苦参碱注射液和丹参注射液对肝纤维化大鼠肝脏病理组织学的影响 [J].中西医结合肝病杂志，2009，19（2）：106 ～ 108.

[4]陆伦根.慢性肝病肝纤维化进程的现今认识 [J].诊断学理论与实践，2005，4（1）：9 ～ 11.

[5]徐晓琪，李民，曹卫菊，等.加味瓜蒌散对肝硬化门静脉高压症患者胃肠激素、肝纤维化指标和血流动力学的影响[J].中西医结合肝病杂志，2009，19（2）：70 ～ 72.

[6]韩德五，马学惠，赵元昌，等.葫芦素B对实验性肝炎与肝硬变的防治作用[J]. 中华医学杂志，1979，59（4）：206 ～ 209.