李杰勤，王丽华，詹秋文，范军成

（安徽科技学院植物科学学院，安徽 凤阳233100）

高粱（Sorghumbicolor）是禾本科一年生草本植物，因其具有抗旱、耐涝、耐盐碱和适应性强等特性，是世界第五大粮食作物，同时又是一种优质饲料作物［1－3］。棕色中脉（Brown midrib，bmr）是指叶脉和茎秆木质部呈棕灰或红棕色的自然或化学突变体。研究发现［4］，叶片中脉颜色与木质素含量和组成有着密切关系。一般认为总木质素含量和木质素单体的组成比例对细胞壁的可消化性影响较大［5］。在饲用高粱及高粱－苏丹草（Sorghum sudanense）杂交种中，棕色中脉与传统的白色中脉品种相比，其叶和秸秆中家畜可消化的纤维素和半纤维素含量增加，而难以消化的木质素含量降低40%～60%，极大地提高了叶和秸秆的适口性，各种放牧家畜特别喜食，同样的饲喂量可获得更高的效益。因此利用棕色中脉突变体来改善饲用高粱及高粱－苏丹草杂交种品质引起了各国研究者的广泛关注。

1924年，棕色中脉突变体首先在玉米（Zeamays）中被发现，接着在高粱、珍珠粟（Pennisetumamericarum）等作物中陆续被发现［6，7］。高粱中的棕色中脉类型较多，目前已经报道的类型有19种，其中既有自然突变体也有化学突变体［8］。在这些类型中，最重要的主要有bmr－6、bmr－12和bmr－18三种类型［9，10］。因为这3种类型的可消化率远高于其他类型，因此应该是与木质素合成有关的基因发生突变的结果。等位分析证明bmr－12和bmr－18是等位基因，bmr－6和bmr－12位于不同的染色体上［11］。日前，bmr－12和bmr－18基因已经克隆，但 bmr－6基因定位还未见相关报道。

本研究利用从美国引进的高粱棕色中脉材料（bmr－6类型）与白色中脉材料的杂交F2分离群体，分析了高粱棕色中脉基因bmr－6的遗传特点，并利用分子标记对bmr－6进行了基因定位，为进一步对bmr－6基因的克隆和利用打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

棕色中脉材料N592是由美国Nebraska－Lincoln大学提供。N592是由N121（bmr－6）与Rox Orange进行多代回交选育而成。

1.2 定位群体的构建

将高粱棕色中脉材料N592分别和白色中脉材料Sa和S722分别进行杂交，获得F1代。将F1植株单穗进行套袋自交，获得F2代分离群体。2008年将该群体种植在安徽科技学院农场中，种植密度为行距50 cm，株距30 cm，常规肥水管理。

1.3 定位亲本叶中脉组织切片

在能辨别棕色中脉和白色中脉性状的6叶期，取N592和Sa的叶中脉，徒手切片，切片置于载玻片上，加入1滴间苯三酚／盐酸试剂（2 mol／L盐酸，1% 间苯三酚，溶于95%乙醇），室温放置1 min后，观察拍照。

1.4 χ2测验

1.5 DNA提取

在6叶期对F2单株的棕色中脉单株进行统计，并取幼嫩叶片。同时取N592和Sa双亲的幼嫩叶片，并做好编号标记。

DNA的提取方法，参照Brown等［12］的方法，取嫩叶片0.5 g，加液氮研磨成粉末，加500 m L提取液（65℃）摇匀，65℃温浴30 min；加20μL KAC（预冷），冰浴20 min，禁止摇动；加400μL氯仿／异戊醇（24∶1）摇匀，10 000 r／min离心10 min；取上清液于离心管中，加入预冷的无水乙醇；吸出位于液面上白色絮状物DNA，之后用70%的乙醇冲洗2次，加无水乙醇脱水1次，保存。

1.6 SSR反应体系

采用25μL体系：10×Buffer（无 Mg2＋）2.0μL，MgCl22.0μL（25 mmol／L），引物：前引物1.0μL（10 μmol／L），后引物1.0μL（10μmol／L），d NTP 2.0μL（25 mmol／L），模板DNA 2.0μL（50 ng／μL），双蒸水14.8 μL。

1.7 SSR标记分析

选取均匀分布在高粱10个连锁群上的171对SSR引物进行PCR扩增。SSR引物为txp系列，具体名称和分布见表1，引物序列参考网站www.gramene.org。SSR引物全部由biosino公司合成。

表1 高粱SSR引物名称及分布Table 1 The SSR markers name and distribution on S.bicolor linkage group

1.8 PCR扩增

PCR反应按如下程序进行：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min循环36次，72℃延伸7 min，4℃保存。反应完成后，加入2.0μL的溴酚蓝，3%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶（EB）染色，凝胶成像系统（PCR）拍照。

1.9 遗传作图

将在亲本间有差异的SSR引物对隐性群体进行PCR扩增，将与母本条带一致的个体赋值为0，与父本一致的为1，双带为2。将群体基因型数据归类，用Exp 3.0b作图软件进行连锁分析［13］，采用Kosambi函数将重组值转换为遗传图距。

2 结果与分析

2.1 N592和Sa的叶中脉表型及其组织切片

普通高粱叶中脉有4种颜色，即白色、绿色、黄色和浅灰色。N592为浅棕色，Sa为白色。两者在颜色上差别较大，但衰老叶片的叶色中脉都为白色。因此，在收获棕色中脉的饲用高粱要早于普通饲用高粱，以便于减少营养损失。

间苯三酚是一种用来检测植物组织中木质素的常用试剂。木质素能和间苯三酚／盐酸试剂产生红色的化合物。因此，如果组织中红色越深则说明木质素含量越高，纤维素和半纤维素含量则相应降低。N592的红色比Sa要浅得多（图1），而且N592被染红的主要分布在韧皮部，而Sa则在髓部、韧皮部、木质部及表皮都被染成了红色。这也说明Sa的木质素含量要远高于N592。

2.2 高粱棕色中脉基因的遗传行为分析

以N592分别与Sa和S722进行杂交，获得的F1代，叶脉表现全为白色中脉，这表明棕色中脉基因为隐性遗传。将F1代进行套袋自交，获得的F2代分离群体。F2分离群体中，白色中脉和棕色中脉分离符合1对等位基因的分离规律（表2）。通过χ2测验，说明棕色中脉bmr－6受1对隐性等位基因控制。

2.3 N592和Sa引物筛选

由于N592和Sa杂交F2群体在数量上和χ2测验的结果都优于N592和S722，因此选择了N592和Sa杂交F2群体为定位群体。选择了171对SSR标记对定位群体亲本进行了PCR扩增，N592和Sa两个亲本间的SSR标记进行了多态性筛选。在扩增的171对引物中，24对能够揭示亲本间的多态性（图2），多态性频率为14.1%。

图1 N592和Sa叶中脉组织切片Fig.1 The midrib histological section

表2 高粱棕色中脉基因的χ2测验Table 2 Theχ2 test of sorghum brown midrib gene

图2 定位亲本间多态性引物筛选Fig.2 Screening of SSR markers in parents

图3 SSR标记txp295在F2隐性群体中的部分扩增结果Fig.3 Amplification of txp295 in F2 recessive population

2.4 共分离标记的筛选

应用在双亲间表现多态性的24对差异标记，对122个F2棕色中脉单株进行PCR扩增（图3）。对标记和基因进行了连锁性分析，发现位于第1连锁群的SSR标记txp295与目的基因连锁。经Mapmaker分析，用Kosambi函数将重组值转换为遗传图距，连锁距离为4.2c M。因txp295位于第7连锁群（表1），初步将该基因定位于第7连锁群上（图4）。

图4 棕色中脉基因在高粱第7号连锁群上的遗传图Fig.4 The genetic map of bmr－6 gene on S.bicolor linkage group 7

本研究采用基因定位方法来对bmr－6基因进行了初步定位，为进一步的基因精细定位奠定了基础。同样的方法也在高粱棕色中脉基因bmr－26的定位上被采用［14］。利用已有的分子图谱对基因进行初步定位，再以这一标记为基点，进行加密探针，可以大大的缩小标记选择的范围，为目标基因精细定位打下基础［15］。本研究利用已公布的高粱分子图谱中的SSR标记，将棕色中脉基因直接定位到已知连锁群上，为进一步筛选引物和该基因精细定位打下了基础，同时也为利用分子标记辅助选择进行棕色中脉品种的选育创造了条件。

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