张晓波,赵 艳,樊俊华

(1.海南大学农学院,海南儋州 571737;2.山西农业大学资源环境学院,山西太谷 030801)

胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)俗称钾细菌,国内一些学者也称为硅酸盐细菌[1]。长期以来对于这个种的特性一直有着不同的意见,其分类地位、名称直到1998年才得到国际上承认[2]。胶质芽孢杆菌是目前应用于生物钾肥中的一种重要功能菌,能分解硅酸盐和铝酸盐组成的含钾矿物,也能活化硅、磷等多种营养元素供作物吸收利用,同时具有固氮功能[3]。

近年来我国大部分地区土壤由于长期偏施氮、磷肥,少施或不施钾肥,使得土壤中钾素被作物大量带走而得不到补充,从而抑制其他元素的吸收影响了作物的生长和高产[4,5]。因此,在钾肥生产污染严重,成本高,供不应求的情况下,研究开发以成本低,又不污染环境的胶质芽孢杆菌为有效活菌的生物钾肥尤为重要[6]。试验对山西地区褐土中筛选到的胶质芽孢杆菌进行了形态特征和生理生化特性研究,为生物钾肥的研制及应用提供基础。

1 材料和方法

1.1 供试土样及菌株

分离胶质芽孢杆菌的土样分别采自山西地区有代表性的褐土(表1)。

胶质芽孢杆菌参照菌株标记为K0,由辽宁省菌种保藏中心提供;从采集土样中分离、筛选的6株胶质芽孢杆菌菌株,标记为 K1 、K2、K3 、K4、K5、K6。

1.2 培养基

硅酸盐细菌培养基参照文献进行[7],蔗糖5.0 g,CaCO30.1 g,Na2HPO42.0 g,FeCl30.005 g,MgSO4◦7H2O 0.5 g,土壤矿物1.0 g,Agar 20 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0。

土壤矿物为去除有机残体的土壤,取校园土3 g,加入20%HCl 30 mL,煮沸30 min,过滤,用蒸溜水淋洗至无氯离子反应。

1.3 方法

1.3.1 根际土样的采集 在每个标准样地内按S形随机选择5个植株,采集根际土样时先去除表层的落叶以及枯草,然后将植株整个带根系小心挖出,轻轻抖落根系上的大块土壤,用刮刀刮下黏附于根系表面约2 mm土壤,带回实验室。

表1 褐土性土壤理化性质Table 1 Basic physical and chemical properties of cinnamon soil

1.3.2 分离与纯化 采用硅酸盐细菌培养基分离。制备土壤悬液10-2,10-3和10-43个稀释度,设3个重复,涂沫平板法,30°C恒温培养箱中培养5 d。挑选符合文献[8]胶质芽孢杆菌菌落特征的典型菌落,在固体平板上划线培养7 d,再挑取单个菌落如此重复划线2～3次,同时镜检其纯度,直至获得纯培养。

1.3.3 菌株生物学特性测定 (1)将供试菌株接种在硅酸盐细菌液体培养基中,置于28℃恒温培养6 h,观察是否形成菌膜、菌环、沉淀或浑浊等特征;用接种环接菌在平板培养基上划线,28℃恒温培养5～6 d,观察并描述其菌落大小、形状、颜色、是否透明、是否粘稠等;(2)用24 h菌龄的纯培养物制片革兰氏染色后镜检观察其染色结果;用淀粉铵盐培养基[9]培养3 d后,用芽孢染色法[10]观察其着生位置、形状等;用斜面培养3 d、7 d的培养物,用负染色法[10]染色观察其荚膜大小及荚膜内菌体变化情况;取连续传代培养两次的菌种接种到新鲜配制的琼脂斜面上(有冷凝水),30℃培养24 h,用硝酸银染色后观察;简单染色后在数码显微镜下测菌体长、宽;(3)在硅酸盐细菌培养基中不加CaCO3,倒平板前用灭菌的HC1或NaOH调节制备几个浓度梯度pH的平板,以pH 7.0为对照,接种后置28～30℃培养,观察记录其生长状况;同时,配制含不同NaCl浓度(1%、2%、3%、4%)的硅酸盐细菌培养基,灭菌后倒平板,接种供试菌株培养,以常规的硅酸盐细菌培养基为对照,观察记录其生长状况及测定耐盐性;再将供试菌株接种于硅酸盐细菌培养基平板上,分别置于10、25、30、40、60 ℃下培养,观察其生长状况和适宜温度;然后将供试菌株活化后(培养18～24 h),接种于硅酸盐细菌培养基斜面上,置于28～30℃培养,7 d后,在丰满的菌苔上滴加l mL 3%H2O2,进行过氧化氢酶检测,5 mm内出现气泡为阳性反应,记录为“+”,否则为“-”;其他生化性状唯一碳源利用、唯一氮源利用、甲基乙酰甲醇试验(VP试验)、淀粉水解、明胶水解、脲酶、酪素水解、产吲跺试验、硝酸盐还原试验、苯丙氨酸脱氨等均按常用方法[11]进行。

2 结果与分析

2.1 生物学特征

2.1.1 培养性状 胶质芽孢杆菌在无氮的硅酸盐细菌培养基上形成直径7～13 mm的无色透明隆起菌落,像半粒玻璃珠平贴于平板上(图1);菌落光滑,湿润有光泽,边缘整齐,粘稠,富有弹性,挑起时能拉成很长的丝;在液体培养条件下,分离的胶质芽孢杆菌能在培养液底部形成透明的雾状沉淀,沉淀胶结成团,不易摇散,培养液不浑浊。

2.1.2 形态特征及染色反应 分离所得到的胶质芽孢杆菌革兰氏染色均为阴性,菌体呈杆状,两端钝圆,菌体大小为(1.14～1.27)×(4.1～7.0)μ m,无鞭毛,在淀粉铵盐培养基上易形成芽孢,芽孢位于孢囊中部,孢囊不膨大。在阿须贝无氮培养基中包围有椭圆形肥大荚膜,这与文献[10]描述的特征一致。荚膜约比菌体大10～20倍,有的2个或多个菌体共用一个荚膜(即菌胶团)(图2),而到了培养后期(第10 d),许多菌体已经消融仅剩下荚膜。

2.1.2 生理生化特征 供试菌株均能在葡萄糖、木糖、甘露醇为碳源的培养基上生长;所有的菌株都能利用硝酸盐和铵盐作为其唯一的氮源;此外还具有硝酸盐还原、淀粉水解等特征,过氧化氢酶、溶菌酶试验均为阳性反应,不水解酪素、酪氨酸,不产生吲哚,苯丙氨基酸脱氨、VP反应、卵磷脂酶均为阴性,这与李杨[13]、何琳燕[14]、贺积强[15]等的研究结果一致(表2)。

图1 胶质芽孢杆菌菌落Fig.1 Pictures of Bacillusmucilaginosus colony

图2 胶质芽孢杆菌荚膜(1000×)Fig.2 Picture of Bacillus mucilaginosus capsule(1000×)

表2 供试胶质芽孢杆菌的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of Bacillus mucilaginosus

供试胶质芽孢杆菌在NaCl浓度为1%～2%的硅酸盐培养基上能够生长。菌株K5在3%NaCl浓度下仍能生长;耐碱能力较强的菌株有K3、K6、K0,这些菌株可以在pH 9.0时生长。结果分析,胶质芽孢杆菌在pH 5.0～9.0可以生长,最适pH 8.0;供试胶质芽孢杆菌在温度25～30℃都可以生长,菌株K2、K6在较低温度10℃能生长,但生长缓慢。

3 讨论

微生物肥料的开发与应用目前尚有许多缺点,但在绿色产品生产,启动土壤磷、钾库资源、减少化肥的投入及环保等诸多方面具有深远的意义,选育优良菌株是该领域持续发展的科研目标。

陈廷伟、陈华癸等[12]发现,硅酸盐细菌在我国分布很广,各地土壤中经常发现,且分离菌株的形态差异不大。贺积强等[15]对40株来自紫色土的硅酸盐细菌进行了包括形态、生理生化特征等52个表型性状的测试,认为硅酸盐细菌在表型特征上存在多样性,主要是胶冻样芽孢杆菌,其余菌株可能是新种。试验在山西褐土6个不同生境土壤样品中分离纯化得到6株胶质芽孢杆菌,在无氮硅酸盐细菌培养基上生长的菌落、菌体与对照菌株一致,同时也与何琳燕等[16]描述一致,表现出特有的生理生化性质,说明胶质芽孢杆菌在各类农田土壤中广泛存在,具有一定的生物多样性。

从山西褐土地区典型植物根际筛选得到的6株胶质芽孢杆菌可为下一步生物钾肥的研制及应用提供材料,对挖掘褐土土壤的潜在肥力,发展褐土地可持续农业具有一定的理论与实际意义[17]。

[1]Liu W X,Xu X S,Wu X H,et al.Decomposition of silicate minerals by Bacillus mucilaginosus in liquid culture[J].Environmental Geochemistry and Health,2006,28(2):120-130.

[2]Wood T M.Validation of Publication of New Names and New Combinations Previously Effectively Published Outside the IJSB[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1998,48:631-632.

[3]葛诚.微生物肥料生产应用基础[M].北京:中国农业出版社,2000:81-84.

[4]李楠,宋建国,刘伟,等.草原施肥对羊草产量和质量的影响[J].草原与草坪,2001,94(3):38-41.

[5]斯确多吉.冷地型混播草坪在不同基肥处理下的坪用性状比较[J].草原与草坪,2001,94(3):46-48.

[6]钟冬梅,马光庭.硅酸盐细菌在农业中应用的研究动态[J].广西农学报,2006,23(3):32-35.

[7]李明.硅酸盐细菌的分离、鉴定及其在生物学教学中的意义[J].生物学通报,2002,37(1):13-15.

[8]惠明,王慧,田青,等.一株脱硅胶质芽孢杆菌的分离与初步鉴定[J].河南科技学院学报(自然科学版),2007,35(3):15-18.

[9]胡开辉.微生物学实验[M].北京:中国林业出版社,2004:216.

[10]李顺鹏.微生物学实验指导[M].北京:中国农业出版社,2003:33-38.

[11]东秀珠,禁妙英,等.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001.

[12]陈廷伟.胶质芽胞杆菌分类名称及特性研究[J].土壤肥料,2002(4):5-10.

[13]李杨,李登煜,黄明勇,等.从盐碱土中分离的几株硅酸盐细菌的生物学特性初步研究[J].土壤通报,2006,37(1):206-208.

[14]何琳燕,殷永娴,黄为一.一株硅酸盐细菌的鉴定及其系统发育学分析[J].微生物学报,2003,43(2):162-168.

[15]贺积强,李登煜,张小平,等.紫色土硅酸盐细菌的表型特征及溶磷解钾能力[J].应用与环境生物学报,2003,9(1):71-77.

[16]何琳燕,盛下放,陆光祥.不同土壤中硅酸盐细菌生理生化特征及其解钾活性的研究[J].土壤,2004,36(4):434-437.

[17]姚拓.促进植物生长菌的研究进展[J].草原与草坪,2002,99(4):3-5.