汪丽芬 ，姜俊芳 ，叶宏伟 ，陶 新 ，周卫东

（1.浙江农林大学森林保护学院，临安 311300；2.浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，杭州310004；3.浙江临安正兴牧业有限公司）

幼龄反刍动物消化道内有益微生物的定植与优势菌群的形成对其营养物质的消化吸收和健康生长至关重要，但出生时，其消化道内并无微生物，主要通过与母体和环境中附着的微生物接触，经过消化道环境的适应和选择，经定植、存活和繁殖，逐步建立较稳定的微生物区系［1］。反刍动物消化道内大多数有益微生物是厌氧菌，因此，消化道厌氧环境对于幼龄动物消化道微生物区系的形成与稳定具有积极意义。

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）为革兰氏阳性大肠杆菌，为需氧菌，也能厌氧生长，能够分解饲料中的糖分，形成酸性厌氧环境，对消化道内耐酸、厌氧微生物有利；其分泌的酪蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶、青霉素酶和超氧化物歧化酶等可促进动物对营养物质的消化吸收，维护消化道健康；同时，其本身含有丰富的菌体蛋白，可为机体提供营养物质［2］。试验通过梯度饲喂蜡样芽孢杆菌活菌剂，研究其对断奶犊牛的生长及肠道微生物菌群的影响，以期为犊牛的健康饲养提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物 选择90日龄左右、健康的黑白花犊牛24头（♀，45日龄断奶），根据体重和出生日期分成3组（每组8头），即对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组，试验牛组间体重无显著性差异（表1），日龄分布基本一致。试验期为90 d，分前期和后期，各45 d。试验在浙江临安正兴牧业有限公司奶牛场进行。

1.2 饲料 试验牛基础饲料由精料、苜蓿草颗粒和苜蓿干草组成。精料为农标普瑞纳（嘉兴）饲料有限公司的超级小牛精料补充料，饲喂量2 kg/（头·d），苜蓿干草为自由采食，苜蓿草颗粒在试验前期投喂，平均为2kg/（头·d）。

蜡样芽孢杆菌剂（粉状）由国外某饲料公司惠赠，活性孢子数为1010CFU/g。用4号粉将原菌剂稀释50倍，试验Ⅰ组投喂15 g/（头·d）（约含3×109CFU），试验Ⅱ组投喂30 g/（头·d）（约含6×109CFU）。稀释菌剂与精料混合后投喂。混合方法：取200 g左右精料于塑料桶中，加适量水润湿精料，按照各组的投喂量，逐一加入蜡样芽孢杆菌稀释菌剂，适当搅拌混合。

1.3 饲养管理 精料和苜蓿草颗粒按照定量每天分早、中、晚3次平均饲喂，自由饮水。蜡样芽孢杆菌剂投喂方法：每天中午喂料前，按照上述方法逐头制作稀释菌剂与精料混合料，将饲料桶固定在特制的铁架中（可放置8个饲料桶），每天按照对照组（无添加）、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组的顺序，先于其它饲料一次性投喂。试验期间其它管理按奶牛场常规程序进行。

1.4 体重和采食量测定

1.4.1 体重 分别于试验初和试验末早晨空腹称重。

1.4.2 采食量 分别于试验期中（试期第45天）和末（试期第90天）各测定一次精料和粗料的日采食量。分类称重并记录当日饲料投喂量，回收并称重剩余量。

1.5 肠道微生物区系分析

1.5.1 粪样采集 分别于试验初和试验末逐头采集粪样于离心管中，置于-20℃冰箱中保存备用。

1.5.2 细菌DNA提取 取0.2 g粪样溶解于6mL PBS液（0.1 M，pH=8），经1 000 r/min离心 5 min后，收集上清液，重复2次，将收集的上清液12 000 r/min离心10 min，收集沉淀。采用细菌基因组DNA提取试剂盒（拜尔特普生物科技发展有限公司，北京）提取粪样细菌DNA，操作参照试剂盒说明进行。

用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测提取细菌DNA的完整性，用NanoDropRND-1000核酸定量仪（Thermo Scientific，Waltham，USA）测定DNA含量，确定模板用量为2.5 μL，DNA提取物于-20℃保存。

1.5.3 PCR扩增 对细菌DNA的16S rDNA V6/V8片段进行PCR扩增，引物为带有GC夹子的U968-GC（F）和L140l（R）［3］，U968-GC 序列为：5′-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3′，L140l 序 列为：5′-GCG TGT GTA CAA GAC CC-3′；引物委托上海英俊生物技术有限公司合成。PCR扩增试剂盒（Premix Ex Taq Version 2.0）购自宝生物工程（大连）有限公司，预计扩增产物片段长约500 bp。

反应体系：0.2 μL U968-GC（10 mΜ），0.2 μL L140l（10 mΜ），12.5 μL Premix（TaKaRa Ex Taq：1.25 u/25 μL，2×dNTP Mixture：0.4mM，2× ExTaq Buffer：4mM Mg2+），2.5 μL 模板 DNA，用 ddH2O 加至 25 μL。

扩增过程：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，57.6℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，35 个循环；72℃延伸 10 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物扩增效果，4℃保存。

1.5.4 DGGE电泳 每组各选取5个样品，参照Muyzer等［4］建立的方法进行DGGE电泳：使用8%变性聚丙烯酰胺凝胶，100%变性储存液中加入40%（V/V）甲酞胺和7 M尿素，变性梯度为29%～48%。PCR产物采用DCodeTM 突变检测系统（Bio-Rad，Hercules，USA）进行分离。运行条件为：0.5×TAE电泳缓冲液，样品点样量为10 μL，在200 V、60℃下电泳4 h。电泳结束后用快速银染法染色。

1.5.5 微生物区系的相似性分析 DGGE电泳凝胶在凝胶成像仪（Bio-Rad，Hercules，USA）中成像，采用该公司Quantity one软件的算术平均非加权成组配对法（unweighted pair group method with averaging algorithm，UPGMA）进行相似性聚类分析。

1.5.6 微生物区系的多样性分析 DGGE图谱多样性指数分析［5-6］包括：

丰富度（richness，S）：DGGE图谱每条泳道上的条带数；

香浓维纳指数（Shannon-Wiener index，H′）：H′=-∑Piln Pi。其中：Pi为第i条泳道上条带吸光度与该泳道所有条带吸光度总合的比值；

菌群均匀度（evenness，E）：E=H′/H′max，H′max=ln S。

1.6 数据处理 结果采用Microsoft Excel整理和统计分析，用单因子方差分析（ANOVA）对各组间进行统计检验，如有显著统计差异（P＜0.05），再采用Tukey分析比较各试验组间的差异。结果用平均数±标准误表示。

2 结果分析

2.1 蜡样芽孢杆菌对犊牛采食量和体重的影响 梯度饲喂蜡样芽孢杆菌对断奶犊牛采食量和体重的影响见表1。除定量的精料补充料外，试验中期Ⅰ组和Ⅱ组的草颗粒日采食量分别比对照组减少50.79%和32.28%，干草日采食量则分别提高35.14%和16.76%，试验末期Ⅰ组和Ⅱ组的干草日采食量分别提高21.99%和13.75%。但对照组、试验Ⅰ组和Ⅱ组间犊牛试验末体重和试验期增重无显著差异（P＞0.05）。

表1 犊牛采食量和体重变化

2.2 蜡样芽孢杆菌对犊牛肠道微生物区系的影响 经检测，犊牛粪样细菌DNA长度大于5 kb，完整性较好。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测到500 bp左右基因片段，与预期结果相符，目的区以外的电泳条带特异性较强，非特异性弥散很弱（图1），可用于下一步DGGE电泳。

图1 试验初（A）、末（B）犊牛肠道微生物16S rDNA V6-V8 PCR扩增

2.3 DGGE电泳图谱相似性分析 试验初犊牛肠道中可以分离到较多条带（图2A），UPGMA相似性分析显示，整体相似性系数为0.58（图3A），且各组间互相交杂在一起，各组间无明显聚集。试验末亮条带数高于对照组，位置也有所不同，整体相似性系数为0.45（图3B），低于试验初（图2B）；对照组条带相对分散，而试验组相对聚集，可聚为一簇（除15），但试验Ⅰ组和Ⅱ组相互交叉。

2.4 DGGE电泳图谱多样性分析 试验初、末各组犊牛肠道微生物区系丰富度、香浓维纳指数和均匀度分别在26.20～28.20、3.19～3.28 和 0.975～0.995 之间，与对照组相比，试验末各试验组无显著差异（表2）。

图2 试验初（A）、末（B）犊牛肠道微生物区系16S rDNA V6-V8区DGGE图谱

图3 试验初（A）、末（B）犊牛肠道微生物区系DGGE图谱UPGMA相似性聚类分析

表2 试验初、末犊牛肠道微生物DGGE图谱多样性分析

3 讨论与结论

3.1 蜡样芽孢杆菌剂可以影响断奶犊牛对粗饲料种类的选择性 饲喂蜡样芽孢杆菌可以明显提高犊牛对干草的采食量，减少对草颗粒的采食量，由于试验前期干草和草颗粒采食量增减相抵，且试验后期试验组干草采食量增量占总采食量的比重较低（试验组平均为10.5%），时间较短（后期45 d），不足以反映到最终的体重和增重上。杨利等［7］用富含嗜酸乳酸杆菌的发酵乳饲喂犊牛，获得与本试验类似的结果。但曹国文等［8］在断奶仔猪和王磊等［9］在幼兔的试验显示，饲喂蜡样芽孢杆菌可分别提高日增重33.6%和19.0%。表明蜡样芽孢杆菌可影响幼龄反刍动物对粗饲料种类的选择性，但短期内对犊牛的增重影响不大。

3.2 蜡样芽孢杆菌剂可以改变犊牛肠道微生物区系的聚类性 PCR-DGGE图谱分析显示，试验初犊牛肠道中已有较多条带，表明断奶犊牛肠道内已有较丰富的微生物存在。饲喂蜡样芽孢杆菌明显改变了犊牛肠道微生物区系的聚类性，表明蜡样芽孢杆菌可使犊牛肠道内微生物菌群发生变化。但是，饲喂蜡样芽孢杆菌剂对犊牛肠道微生物区系多样性指数均无显著影响，这与杨利等［7］用富含嗜酸乳酸杆菌的发酵乳饲喂犊牛的试验结果一致。于萍等［10］认为，日粮组成和宿主是影响肠道微生物区系的两大主要因素；几种活菌定植性研究［11］表明，健康动物消化道菌群之间相互依赖、相互拮抗，处于相对稳定状态，不因饲喂微生态制剂种类、数量而发生显著改变。研究结果证实了短期内饲喂外源性微生物对幼龄反刍动物肠道微生物区系多样性影响有限。

［1］冯仰廉.反刍动物营养学［M］.北京：科学出版社，2004.

［2］陆承平.兽医微生物学［M］.北京：中国农业出版社，2005.

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［4］Muyzer G，de Weel E C.Uitterlinden A G.Profiling of complex micro bial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59（3）：695-700.

［5］Klein G，Hallmann C，Casas I A，et al.Exclusion of vanA，vanB，and vanC type glycopeptide resistance in stains Lactobacillus reuteri and Lactobacillus rhamnosus used as probiotics by polymerase chain reaction and hybridization methods［J］.Journal of Applied Microbiology，2000，89：815-824.

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［7］杨利，李建国.微生态制剂对反刍动物的影响［J］.饲料研究，2005（3）：38-40.

［8］曹国文，姜永康，陈春林，等.植物源蜡样芽胞杆菌在动物体内的生物效应［J］.中国兽医科技，2003，33（2）：43-46.

［9］王磊，谷子林，刘亚娟，等.蜡样芽胞杆菌制剂对弗朗德幼兔生产性能、肠道菌群及部分血液生化指标的影响［J］.黑龙江畜牧兽医，2007，10：98-99.

［10］于萍，王加启，卜登攀，等.反刍动物胃肠道微生物多样性研究进展［J］.中国微生物学杂志，2009，21（7）：655-658.

［11］熊德鑫，祝小枫，盛志勇，等.几种活菌的定植性研究［J］.中国微生物学杂志，1995，7（3）：8-11.