郑智 李冬云 陈菊 刘朝阳 陈信义

多药耐药(multidrug resistance，MDR)是白血病化疗治疗的最大难点，如何逆转白血病多药耐药也是国内外研究的难点和热点。我们的临床研究表明，分别由浙贝母、汉防己、川芎三味中药组成的复方浙贝颗粒饮片(compound zhe bei granule，CZBG)与化疗药物伍用能够提高难治耐药性急性白血病患者骨髓缓解率，表明该方可能具有逆转白血病多药耐药效应[1-4]；体外基础实验也证明，该方中单味药提取的活性成分能够增加白血病细胞内抗癌药物浓度，下调多药耐药相关蛋白基因(Pgp)高表达[5-7]。基于以上背景资料，拟通过移植瘤实验，考察CZBG联合阿霉素逆转多药耐药白血病细胞K562/A02效果。

1 材料与方法

1.1 细胞株及动物 K562/A02细胞由中国医学科学院血液学研究所提供；清洁级BALB/c-nu裸小鼠60只，8～10周龄，雌雄各半，购于中国医学科学院实验动物研究所，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2005－0013，SPF级动物房饲养。

1.2 仪器与试剂 CO2培养箱，Heraeus；RPMI1640培养基和胎牛血清，Hyclone产品；复方浙贝颗粒(CZBG，浙贝母、汉防己、川芎)由北京康仁堂药业有限公司制备并提供；注射用盐酸多柔比星(doxorubicin，阿霉素)，深圳万乐药业有限公司，国药准字：H44024359。

1.3 方法

1.3.1 建立动物模型 K562/A02细胞用含ADR1μg/mL的10%胎牛血清的RPMI－1640培养基，37℃、5%CO2、饱和湿度，细胞培养箱内培养，2～3d换液一次；收集对数生长期细胞，1000rpm，离心5min，无血清RPMI－1640培养基稀释，制成细胞悬液，细胞悬液密度4×107/mL，于裸鼠右前腋侧皮下注射0.2mL，注射后2～7d可见到瘤块开始生长增大，未见到瘤块消退。

1.3.2 分组与给药 K562/A02细胞接种后60只荷瘤鼠全部成瘤，测量肿瘤最大径(a)和最小径(b)，计算肿瘤体积(V):V=ab2/2，将肿瘤体积过大及过小者排除，共有50只荷瘤鼠进入实验，按随机数字表法分成5组，分别为生理盐水对照组，阿霉素对照组，CZBG高剂量组，CZBG中剂量组和CZBG低剂量组，每组各10只荷瘤鼠。细胞接种后第8天开始给药，其中，生理盐水对照组以生理盐水0.2mL/10g，灌胃，每日1次。阿霉素对照组以阿霉素1mg/kg(按成人40mg/(m2·d)换算)，腹腔注射，隔日1次。CZBG高剂量组(8g/kg，临床用药剂量的14倍)，灌胃给药，每日1次；阿霉素1mg/kg腹腔注射，隔日1次。CZBG中剂量组(4g/kg，临床用药剂量的7倍)灌胃给药，每日1次；阿霉素1mg/kg腹腔注射，隔日1次。CZBG低剂量组(2g/kg，临床用药剂量的3.5倍)灌胃给药，每日1次；阿霉素1mg/kg腹腔注射，隔日1次。共14d。

1.3.3 瘤块体积与抑瘤率计算 给药后每4天用游标卡尺测1次肿瘤体积，直至给药结束前1天，取各组平均值，绘制肿瘤生长曲线；实验结束，完整剥离肿瘤，称瘤块重量，并按照公式(抑瘤率(IR)=[1－(试验组瘤块重量/对照组瘤块重量)]×100%)计算抑瘤率。

图1 各组移植瘤体积生长曲线

表1 实验各组瘤重和抑瘤率

1.3.4 统计学分析方法 各分组所得计量数据采用均数±标准差(±s)表示，用SPSS10.0软件处理数据，组间均数比较用t检验。检验水准α=0.05，P＜0.05被认为有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状态观察 各组动物至实验结束无一只死亡，均全部进入指标检测。在实验过程中，各组动物能正常进食，活动自如，无明显消瘦。

2.2 肿瘤生长曲线比较 接种后第12天(给药后第4天)，各组肿瘤生长平缓，各组肿瘤体积比较，无统计学意义(P＞0.05)；用药后16d，CZBG各组生长曲线较平缓，但未停滞，而对照组和阿霉素组生长较快，曲线陡直；用药后20d，CZBG各组与化疗组比较，有统计学意义(P＜0.05)。其中，CZBG高剂量组生长最缓。各组肿瘤生长曲线见图1。

2.3 瘤重和抑瘤率比较 实验结束后处死小鼠，剥离肿瘤称重，并依据实验各组瘤重计算肿瘤抑制率，各组瘤重与抑瘤率见表1。从表1可以看出，CZBG中、高剂量伍用阿霉素能够明显提高抑瘤率，与阿霉素组比较，分别提高了68.9%(中剂量组)与145.5%(高剂量组)，表明CZBG中、高剂量能够明显增加阿霉素对耐药性白血病细胞(K562/A02)杀伤的敏感性。

3 讨论

研究表明，以多药耐药人白血病耐阿霉素的K562/A02细胞系建立的裸鼠耐药移植瘤模型，仍保持近似体外的耐药活性和基因表型，故该模型是一种良好的研究白血病多药耐药发生机制和逆转耐药的体内动物模型[8]。我们在利用该细胞系开展单味中药提取的活性体外抗多药耐药机制研究基础上，结合耐药白血病的中医临床特点，在中医辨证施治理论指导下拟定的复方浙贝颗粒(浙贝母、川芎、汉防己)，并通过(颗粒饮片)随机双盲、安慰剂对照、多中心临床研究证实，该组中药(复方)伍用化疗药物能够明显提高难治耐药性急性白血病的骨髓缓解率，并具有较为明显的抗化疗不良反应效果，说明该组中药具有化疗增敏效应。在本实验中我们引用多药耐药人白血病耐阿霉素的K562/A02细胞移植瘤模型来研究复方浙贝颗粒增加阿霉素对耐药移植瘤杀伤的敏感性，试图通过该研究进一步深入探讨该方逆转白血病耐药机制。研究结果表明，复方浙贝颗粒不同给药剂量均有不同程度的增加阿霉素对K562/A02移植瘤的杀伤效应。其中，复方浙贝颗粒低剂量组伍用阿霉素与单用阿霉素的肿瘤抑制率相似；而复方浙贝颗粒高、中剂量组伍用阿霉素能够明显提高肿瘤抑制率，与单用阿霉素组比较，肿瘤抑制率分别提高了68.9%(中剂量组)与145.5%(高剂量组)。该实验结果验证了复方浙贝颗粒伍用化疗药物能够提高难治耐药急性白血病骨髓完全缓解率的可靠性。对于复方浙贝颗粒增加阿霉素对K562/A02移植瘤的抑瘤机制，我们试图通过检测肿瘤组织多药耐药相关蛋白表达、细胞凋亡以及相关酶变化来进一步说明。

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