任晓萍 樊昕 杨蓉娅 夏志宽 李海涛

(1.北京军区总医院全军皮肤病诊治中心,北京 100125;2.运城市中心医院,山西 044000)

阿萨希毛孢子菌 (T.asahii)在自然界中广泛存在,是毛孢子菌属中最重要的临床致病菌,可导致播散性毛孢子菌病及夏季超敏性肺炎。调查发现,毛孢子菌已成为仅次于隐球菌和酿酒酵母的第三位常见的非白念株菌酵母[1,2]。与浮游状态相比,阿萨希毛孢子菌生物膜细胞对抗真菌药物的耐药性明显增加[3,4]。生物膜被定义为微生物聚集在一起,由其自身产生的细胞外基质包裹的菌细胞群体,不仅可在自然界产生,也可在宿主体内产生,是微生物的一种独特的生存方式[5]。生物膜导致耐药性增加的机制目前尚不完全清楚。研究发现很多因素可以影响真菌生物膜的形成,如物理性质:基质,碳源,唾液的存在,氧气的存在,表面限定,酸碱环境;环境因素:热,冷,紫外线;真菌的种类[5]。成熟真菌生物膜的结构主要受附着层表面材料的影响[6]。本实验以聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯为生物膜黏附基质观察不同基质对阿萨希毛孢子菌生物膜形成的影响,为临床医用材料的选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株 阿萨希毛孢子菌株 1株,来源于本院皮肤科临床分离株 (BZP07002),并经 API20AUX生化鉴定及 DNA序列分析验证 (AS2.2174)[7]。

主要试剂及材料 XTT试剂:AppliChem公司,PMS:Sigma公司,扫描电镜:HITACHI S-520,由北京市神经外科研究所提供。

1.2 方法

生物膜体外构建[3]将-80℃保存的阿萨希毛孢子菌菌种复苏,在沙氏培养基中转种培养 2次,转入酵母蛋白胨葡萄糖肉汤 (YPD)中过夜振荡培养,离心、收集后,重悬于 RPMI-1640中,稀释成106CFU∕ mL菌悬液。在培养板中预先放入无菌的聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯 (长宽各为 1.0 cm),每种材料共 9个,分 3个孔放入。将 2.0 mL该菌悬液加入到 24孔培养板中,28℃培养 72 h。2 h时 PBS缓冲液冲洗2次,重新加入 2.0 mL RPMI-1640培养液。之后每隔 24 h更换一次培养液。设不加有阿萨希毛孢子菌的空白对照组。

生物膜形成的定量分析[3]通过 XTT还原比色测定法进行定量分析。测定依据通过代谢活性细胞使黄色的四唑盐 XTT分裂成橘黄色的甲臜染料。RPMI-1640培养液中加入 XTT和电子耦合剂PMS使终浓度为 12.5μmol/L。在预先洗涤培养0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h、72 h的生物膜孔63个 (每组 3孔,每孔 3个,共 7组)和空白对照孔中放入 1.5 mL的 XTT-PMS溶液,28℃避光培养 2 h。离心上清液平分在 96孔板中,微量滴定板 492 nm下读数。

倒置显微镜观察 将培养 2 h、4 h、8 h、24 h、48 h、72 h的含生物膜的聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯用灭菌的 PBS缓冲液冲洗2次,放置在载玻片上倒置显微镜下观察。

扫描电镜观察 选培养 48 h的含生物膜的聚芳脂、聚苯乙烯材料常规扫描电镜制片并观察其形态。

1.3 统计学方法

用 SPSS 13.0统计软件分析。采用单因素方差分析 (F)和 LSD-t检验进行多个样本均数的两两比较。取 α=0.01为检验水准,P<0.01为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 菌株在体外生物膜的形成及定量测定

表 1显示 3种材料在 1 h、2 h、4 h、8 h、24 h、48 h、72 h各时间点上形成生物膜的活力,随时间延长,生物膜的活力逐渐增强。对成熟期 48 h的生物膜活性采用方差分析表明不同材料上形成阿萨希毛孢子菌生物膜的活性有差别 (F=14.743,P<0.01,见表 2),采用 LSD-t检验进行多个样本均数的两两比较,聚芳脂与聚氯乙烯的活性差别无统计学意义 (P>0.01),其余材料两两比较差别均有统计学意义 (P<0.001)。说明不同材料上形成生物膜的活性有差别,活性由高到低为聚芳脂材料 =聚氯乙烯材料 >聚苯乙烯材料。

2.2 倒置显微镜下形态

实验发现材料聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯在2 h时均有微生物黏附,随时间延长,生物膜形成逐渐增多,经历黏附期,形成期和成熟期。且其形成的生物膜广泛,覆盖整个材料。观察发现聚芳脂、聚氯乙烯形成的生物膜可见孢子、菌丝、假菌丝结构,聚苯乙烯上形成以孢子为主要结构的微生物群落 (见图 1～3)。

表 1 阿萨希毛孢子菌在 3种材料上形成生物膜的定量 XTT值测定 ( x±s)Tab.1 Analysis of the activity of T.asahiibiofilm by XTT on 3 kind of support materials( x±s)

表2 不同材料上 48h阿萨希毛孢子菌生物膜活性方差分析结果Tab.2Analysisof the activityof T.asahiibiofilm on 3kind of support materials

2.3 扫描电镜下形态

观察在聚芳脂、聚苯乙烯材料表面培养 48h的阿萨希毛孢子菌生物膜在扫描电镜下的结构,放大倍数分别为 ×2 000,×5 000。聚芳脂扫描电镜下可见生物膜为多层结构,包括所有真菌形态 (关节孢子、假菌丝、菌丝),形成一个复杂的三维立体架构。镜下可见串珠状孢子,关节孢子,部分孢子上可看到绒毛状结构(见图4)。聚苯乙烯表面生物膜在扫描电镜下观察为一个个的形态不规则的孢子。未见菌丝和假菌丝 (见图 5)。

图 1～3 分别示聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯 3种材料上倒置显微镜下 T.asahii生物膜的形态 (a.2 h,b.48 h,c.72 h;×200)。2 h时为散在的芽生孢子结构;48 h时孢子、菌丝、假菌丝结构相互缠绕聚集,并被胞外多糖基质包绕。1c,3c可见孢子、菌丝、假菌丝结构;2c镜下主要为孢子结构。3种材料镜下形成的生物膜均很广泛 图 4 聚芳脂上 48 h时扫描电镜下阿萨希毛孢子菌生物膜形态,可见菌丝、关节孢子、串珠状孢子,部分孢子上可看到绒毛状结构 (a.×2 000;b,c.×5 000)Fig.1-3 Morphological characteristics of T.asahiiobserved under inverted microscope on 3 different support materials:PAT,polystyrene and PVC(a.2h,b.48h,c.72h;×200).After 2hours,adherent buddingyeast cells stuck tothematerials in arandommanner.During the maturation phase(48to 72 h),thecomplexity of the biofilmincreased froma monolayer intoa multilayered-structure,involving all fungal morphology(yeast cells,hyphae,and pseudohyphae).1c,3c.yeast cells,hyphae,and pseudohyphae;2c.yeast cells.Widespreading bioform was observed on 3 kind of material Fig.4 Morphological characteristics of T.asahiibiofilm under scanning electron microscope on PAT:hyphae,arthrospore,bead-like spore,villiform structure(a.×2 000;b,c.×5 000)

图 5 聚苯乙烯上 48 h时扫描电镜下阿萨希毛孢子菌生物膜形态,只见孢子结构 (a.×2 000,b.×5 000)Fig.5 Morphological characteristics of T.asahiibiofilm under scanning electron microscopeon polystyrene:spore only(a.×2 000,b.×5 000)

3 讨 论

播散性毛孢子菌病呈世界性分布,是一种慢性、顽固、难治的系统性真菌病,其发病呈逐年上升的趋势[8],T.asahii是引起该病的重要致病菌。在对 T.asahii所致播散性毛孢子菌病的临床研究中发现,尽管使用抗真菌药物,但感染仍持续存在。2006年 Giovanni[3]等发现与浮游状态的菌株相比,T.asahii生物膜细胞对两性霉素 B、卡泊芬净、伏立康唑和氟康唑的最低抑菌浓度 (MICs)明显增加,国内李继红[4]等也发现固着相即生物膜细胞的MIC比浮游相成倍提高。近年来各种医用材料(各种支架、导管、瓣膜、起搏器、人工关节等材料)的使用率很高,而微生物易于黏附于其表面且可形成生物膜,导致耐药性增加而感染灶不易清除[9]。Giovanni[8]首先在体外聚苯乙烯材料表面成功构建T.asahii生物膜,证明 T.asahii生物膜的存在。研究表明[10],微生物的致病力与其在聚合材料表面形成生物膜的能力呈正相关。

本实验以医学上常用的各种导管材料聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯为黏附基质,观察不同支撑材料对阿萨希毛孢子菌形成生物膜的影响。研究发现塑料材料 (聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯)上生物膜形成经历真菌表面黏附、微菌落形成和生物膜成熟的典型步骤,且 3种材料的生物膜黏附时间、聚集及形成复杂三维立体结构的时间接近,且形成的生物膜结构均为广泛性的;采用 XTT比色法观察生物膜活性时发现生物膜中阿萨希毛孢子菌的活性随培养时间延长而增加,当生长趋于成熟时,代谢的活性相对稳定,但仍保持在一个高水平,这表明即使是在成熟的生物膜中,细胞的数量也有增加,处于一态平衡中,这与荧光显微镜下观察结果一致[11]:在初始阶段,有散在的阿萨希毛孢子菌黏附在支撑材料上,其中有少量的死菌,随时间延长,阿萨希毛孢子菌逐渐聚集成团块,活菌和死菌的量都增加。研究表明,基质的生理化学特点可影响真菌的黏附从而影响生物膜的形成。不同导管材料上形成的真菌生物膜量亦不同。本实验发现在聚芳脂、聚苯乙烯、聚氯乙烯上均能形成生物膜,倒置显微镜下观察发现聚芳脂、聚氯乙烯形成的生物膜可见孢子、菌丝、假菌丝结构,聚苯乙烯上形成以孢子为主要结构的微生物群落。扫描电镜下更清楚的发现微生物群落组成的差异。分析 XTT比色测定的定量结果可推测菌丝、假菌丝的活力比孢子的活力强。

本实验表明不同材料上形成阿萨希毛孢子菌生物膜的能力不同,聚芳脂、聚氯乙烯比聚苯乙烯更易于真菌的黏附;且证实了以菌丝、假菌丝为主要结构的微生物群落活力比单纯孢子的活力强。针对医学材料上形成生物膜导致抗真菌药耐药性增加,研究人员提出了许多干预措施:Chandra[12]发现 6%的聚氧化乙烯修饰的聚醚氨基甲酸乙酯比同类未修饰的材料以及其他种类的材料形成白色念珠菌生物膜的能力降低。国内马荣华[13]等发现纳米银水凝胶涂膜可有效减少气管导管表面铜绿假单胞菌的黏附数量,延缓导管表面细菌生物膜形成,其作用强弱随培养时间及单位面积中的纳米银剂量的变化而变化。提示对常用的医学生物材料的改良和特殊处理在防治微生物生物膜感染上具有很好的前景。本实验不足之处是未对阿萨希毛孢子菌生物膜进行药敏试验。

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