迎春樱组培无菌外植体获得方法初探

2010-05-15南程慧王贤荣汤庚国

湖北民族大学学报(自然科学版) 2010年3期

南程慧,王贤荣,汤庚国,顾宇

(南京林业大学森林资源与环境学院，江苏南京 210037)

迎春樱(CerasusdiscoideaYü et Li)属蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)樱属(Cerasus)，小乔木或乔木，野外调查过程中发现部分单株树高可达15 m.伞形花序着花1～3朵；总苞片褐色，倒卵状椭圆形；苞片绿色，近圆形或扇形,果期宿存；萼筒管形钟状，外面被稀疏柔毛，萼片长圆形，平展或反折；花瓣椭圆形，先端两裂；核果红色或紫红色.迎春樱花色粉红，先叶开放，为早春优质的观花植物.主要分布于我国的安徽、浙江、江西、福建等地，生于山谷林缘或溪边灌丛中，海拔200～1 100 m处[1,2].

我国野生樱花资源丰富,但引种开发利用较少,仅有高盆樱(Cerasuscerasoides)、钟花樱(Cerasuscampanulata)、野生早樱(Cerasussubhirtellavar.ascendens)等少数种或变种进行过繁殖利用方面的研究[3-10].迎春樱作为华东低海拔地区的早春观花树种,至今还未有引种繁殖利用方面的研究见诸报道，作者仅见南京中山植物园、南京梅花山、杭州植物园、武汉植物园及江西农业大学对其进行园林利用，且多属直接的野外成树移植.为合理保护和开发利用野生迎春樱资源，丰富华东地区园林观赏树木种类，本实验进行了迎春樱组培无菌外植体获得方法的初步研究，以期为迎春樱进一步的组培快繁提供依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

2009年5月采于安徽黄山桃花峰的迎春樱成熟果实，经堆沤软化后，水洗干净；果核室温下于光亮处阴晾一周；装入密封塑料袋中，置于3℃左右冰箱中低温冷藏备用.

2010年5～8月于南京中山植物园采集迎春樱当年生半木质化嫩枝作为实验材料.

1.2 实验方法

1.2.1 沙床苗外植体实验检测低温冷藏10个月的迎春樱果核千粒重、生活力等指标；随机选取迎春樱带内果皮种子，打破内果皮，取出种子作为实验材料；自来水冲洗30 min后，70%酒精浸泡30s，0.2% HgCl2溶液浸种3 min,无菌水冲洗5～6次后,浸泡30 min,除去残余HgCl2；用不同浓度的GA(分子式C19H22O6,分子量346.37)溶液浸种6 h后，将处理好的迎春樱种子置于经过120℃高温消毒过的培养皿沙床中，沙床用对应浓度的GA溶液润湿[11]；在温度为15℃，光照强度为1 500～2 000lx，黑暗8 h，光照16 h的光照培养箱中进行种子发芽实验，观测记录不同时间的发芽生长情况.每种GA处理3个重复，每个处理100粒种子，未经GA浸泡的作为对照试验.迎春樱种苗生长40 d左右具有两片真叶时开始组织培养实验.

参照闫道良、荣冬青钟花樱、野生早樱培养基的配置方法[5,7,8]，配置MS+BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L的启动培养基，其中pH为5.8，蔗糖30 g/L，琼脂粉7 g/L；将生长30、40、50、60 d具有两片真叶的迎春樱沙床苗于超净工作台上，剪去幼根，无菌水冲洗3遍，70%酒精浸30 s后，0.2%HgCl2溶液浸泡3 min，取出种苗，无菌水冲洗5～6遍；将每个材料剪成带子叶和带真叶的茎段接种于配好的培养基上，每种处理接种30瓶，每瓶2个茎段.培养室中观测记录外植体启动、污染等情况.

1.2.2 种胚外植体实验按照沙床苗外植体种子检测、消毒方法对迎春樱种子进行处理，去除GA溶液处理[12-15]；分别配置MS+GA0.05 g/L、MS+GA0.1 g/L、MS+GA0.15 g/L、MS+GA0.2 g/L的启动培养基，以不添加任何生长调节物质的MS培养基作为对照，每个处理20瓶，每瓶接种3粒种子(pH、蔗糖、琼脂粉同沙床苗实验)；培养室中观测记录不同时期种胚的发芽、污染等情况.

1.2.3 茎段外植体实验于5、6、7、8月份分别采集迎春樱当年生嫩枝，剪去枝条上的叶片后，用洗衣粉洗去枝条上的污渍；将枝条剪成2～3 cm带腋芽的茎段，其中5、6、7月份接种材料均为当年生带腋芽茎段，8月份接种材料一部分为当年生带顶芽茎段，其余为腋芽茎段；于自来水下冲洗3～4 h后作为实验外植体；将外植体在70%酒精中浸泡30 s,0.2%的HgCl2中浸泡15 min，无菌水冲洗5～6遍后，用无菌滤纸吸干表面的水分；将消毒后的材料剪成1.5～2 cm的茎段，接种于MS+BA1 mg/L+NAA0.1 mg/L启动培养基上每次接种30瓶，每瓶2个茎段；培养室中观测记录不同时期种胚的启动、污染情况[5-8].

1.3 培养条件

培养温度为23±2℃;日光灯照明，光照强度为1 500～2 000 lx;每天光照16 h.

2 结果与分析

2.1 GA处理对迎春樱种子休眠的影响及沙床苗组培外植体的选择

迎春樱带内果皮种子于3℃低温条件下干藏10个月后,种子生活力为97.6%，说明低温干藏有利于迎春樱种子保存.对赤霉素处理过的迎春樱种子进行沙床发芽试验发现，经赤霉素处理种子6 d后胚根伸出，对照试验未有胚根伸出；10 d时赤霉素处理过种子发芽率分别为 58.3%、61.7%、58.3%、65%(见表1)，对照试验未有种子发芽，仅有8.3%的种子有露白现象；20 d左右时,对照实验开始有部分种子发芽,发芽率为5.0%;40 d时四种赤霉素浓度处理过种子发芽率接近最大值,分别为86.7%、86.7%、91.7%、96.7%，对照试验仅为10.0%，此时多数种苗具有2片对生真叶，未发芽种子及露白种子不再生长，对照试验及赤霉素浓度分别为0.05、0.1 g/L的处理种子形成的种苗开始有所污染，60 d时所有处理及对照试验材料污染加剧.

根据以上试验结果可知，迎春樱种子具有休眠特性，仅有低温无法有效打破迎春樱种子的休眠作用；对低温干藏种子进行不同浓度赤霉素处理后，迎春樱种子发芽率显著提高，且随着赤霉素浓度的提高发芽率逐渐提高，以0.2 g/L赤霉素处理过的迎春樱种子发芽率最好，40 d时可达96.7%(如图1),未经赤霉素处理的对照实验,种子发芽迟缓,且发芽率极低，据此说明赤霉素处理可有效打破迎春樱种子的休眠作用,促进其快速萌发.

表1 不同GA浓度处理沙床苗发芽观测结果

表2 不同生长时期沙床苗外植体接种15 d时污染、分化结果

从表2实验结果可知，具有两片左右真叶的迎春樱沙床苗于不同生长时期接种在MS+BA1 mg/L+NAA0.1 mg/L培养基上，培养15 d时，芽的诱导及污染情况存在差别.光照培养箱培养30～40 d的迎春樱沙床苗，芽的诱导率较高，带子叶外植体和未带子叶外植体诱导情况近相等；用生长30、40 d的沙床苗做外植体，生长15 d时平均诱导率在分别为68.3%、65.0%，且污染率相对较低,平均污染率分别为18.3%、25.0%；用光照培养箱培养50 d的迎春樱沙床苗作外植体，接种后芽的诱导率开始下降，污染率明显升高；光照培养箱培养60 d的沙床苗作外植体，接种材料培养15 d时污染严重，平均污染率达75.0%.对MS+BA1 mg/L+NAA0.1 mg/L培养基培养一段时间的无菌材料进行相同培养基转接，转接后生长40 d，从叶腋分化出1～3个，高2～3 cm的丛芽(如图2).

沙床苗是由经过消毒的迎春樱种子发育而成，各部位器官幼嫩，且培养条件是在无菌的光照培养箱中进行，获得的材料病菌较少，随着培养时间的延长，沙床苗逐渐开始污染，光照培养箱培养30～40 d的迎春樱沙床苗是较为理想的外植体材料；生长50～60 d的迎春樱沙床苗由于自身感染病菌严重，作为外植体接种后污染严重，已不适合作外植体材料.

图1 GA浓度为0.2 g/L的40 d沙床苗图2 A处理增殖芽

2.2 不同浓度GA处理的MS培养基对迎春樱幼苗分化的影响

GA处理过的MS培养基可诱导成熟迎春樱种胚形成幼苗,不同GA浓度处理的MS培养基对迎春樱种胚苗的诱导存在差别(如表3),MS+GA0.05 g/L培养基对种胚苗的诱导率相对较高,为23.3%；对照实验中迎春樱种胚苗的诱导率极低,仅为3.3%，明显低于其它处理的诱导率；培养25 d时,几种处理种子污染严重;未萌发种子于25 d时逐渐失去活力,丧失萌发能力.

表3 不同GA处理25 d时种胚分化结果

表4 MS+BA1 mg/L+NAA0.1 mg/L培养基对迎春樱芽诱导的结果

表5 不同处理40 d后芽苗的增殖结果

本实验后期种子污染严重，未能很好反映不同浓度GA的MS培养基对迎春樱种胚苗诱导率的大小差异，但与对照试验相比，赤霉素处理过的MS培养基可有效打破迎春樱种子休眠，促进其种胚苗的诱导，提高诱导率，说明基本的MS培养基不能有效打破迎春樱种子的休眠作用，赤霉素处理可有效打破迎春樱种子的休眠作用,促进其快速萌发，这与沙床苗发芽观测试验结果一致.用此种方法获得的无菌苗进行芽的诱导，诱导率在90%以上.

2.3 迎春樱茎段外植体芽的诱导

由表4可知，接种于MS+BA1 mg/L+NAA0.1 mg/L培养基上的迎春樱带腋芽嫩枝茎段，培养25 d时观测发现，芽的诱导率均较低，5月份芽的诱导率为2.8%，6月份为1.1%，7月份为0；5月份接种材料污染率较低，但褐化率高，为93.0%，6、7月份接种材料的污染率明显提高，分为80.0 %、94.3%，褐化率也因此下降，分别为18.9%、5.7%.8月份诱导率为30.0%,诱导丛芽发生茎段均为带顶芽的材料,当年生带腋芽茎段未有丛芽发生,污染、褐化材料均为带腋芽茎段.

迎春樱枝叶幼时毛被明显，叶缘腺体分泌粘液，易沾染病菌，5、6、7、8月份获得的带腋芽茎段外植体难以像钟花樱、野生早樱一样获得较好的丛芽诱导效果，褐化率、污染率较高，不适宜作为芽诱导的外植体材料.而正在生长的带顶芽茎段8月份尚能有效诱导丛芽发生，说明迎春樱的丛芽发生与外植体的幼嫩程度有关，带顶芽茎段可作为迎春樱的外植体材料.

2.4 迎春樱丛芽增殖培养

将前两种试验方法获得的无菌材料分别进行继代转接，其中一处理转接至MS+BA1 mg/L+NAA0.1 mg/L培养基上，培养40 d时进行观测记录，记为处理A；另一种先转接至MS+BA6 mg/L+NAA0.05 mg/L的培养基上培养10 d后，再转接至MS+BA1 mg/L+NAA0.1 mg/L培养基上， 30 d时观测记录分化结果，记为处理B；第三种直接种至MS+BA6 mg/L+NAA0.05 mg/L培养基上，40 d时观测记录诱导分化结果，记为处理C.

由表5可知,A处理增殖系数最小,为2.2%,增殖芽数量少,但芽苗叶形正常,生长健壮(如图2)；B处理增殖系数最大，达16.5%，增殖芽苗数量极多，但部分芽苗成莲座状，叶片卷缩(如图3)；C处理芽苗介于A、B之间，增殖系数为5.8，增殖芽叶腋处又有丛芽，芽苗前期生长较快，后期生长缓慢，芽苗较生长较弱，叶片浅黄绿色(如图4).

3种处理均能不同程度诱导分化出丛芽,说明迎春樱丛芽的增殖诱导相对较容易；B处理中，前期培养基中BA含量较高，后期降低，增殖芽数最多，据此推测前期高浓度的BA刺激对迎春樱丛芽的诱导有利；C处理前期芽苗增殖明显，后期芽苗生长变弱，叶色发黄，据此推测含有高浓度BA的MS培养基,对迎春樱丛芽的诱导有利，但对其正常生长不利.因此，迎春樱丛芽的诱导可采用前期高浓度的BA刺激诱导丛芽，后期减少BA含量进行增殖壮苗的方法来诱导分化.

3 结论与讨论

低温干藏可有效保存迎春樱种子，但不能有效打破其休眠；不同浓度赤霉素浸泡6 h的迎春樱种子于沙床培养40 d后，以0.2 g/L浸泡过的种子发芽率最高，达96.7%；接种于含有不同浓度赤霉素的MS培养基上的迎春樱种子，可有效诱导出完整幼苗，但此种方法污染率高，诱导率低；两种赤霉素处理方法均说明迎春樱种子具有休眠作用，赤霉素处理可有效打破迎春樱种子的休眠作用,促进其快速萌发.

图3 B处理增殖芽图4 C处理增殖芽

3种外植体获得方法中，以光照培养箱培养30～40 d的迎春樱沙床苗作为位外植体最为理想，平均诱导率为65.0%～68.3%；不同浓度GA处理的MS培养基诱导形成的无菌苗，由此种方法形成的无菌苗进行芽的诱导，诱导率在90%以上，污染极少，但此种方法前期无菌苗难以获得，诱导无菌苗时污染严重，启动困难，浪费种子及培养基；用当年生嫩枝的带腋芽茎段为外植体，诱导率最低，污染严重，不宜作为组培外植体材料，而以当年生带顶芽幼嫩茎段为外植体，芽的诱导发生容易，为理想的外植体取材部位.

本实验B处理具有较高的增殖系数，丛芽诱导显著，因此，迎春樱丛芽的诱导可采用前期高浓度的BA刺激诱导丛芽，后期减少BA含量进行增殖壮苗的方法来诱导分化，具体的激素配比还需进一步的研究.

参考文献:

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