覃建明 莫文电 谭忠谋

(1广西河池市人民医院，广西河池市新建路 91号，547000;2广西河池药检所)

老年咳喘片由黄芪、白术、防风、甘草、黄精、淫羊藿、补骨脂制成，有滋阴壮阳、扶正固本的功效，可以提高免疫力，促进病体康复，用于老年慢性支气管炎及各种体虚症。补骨脂含香豆精类、黄酮类、单萜酚类以及挥发油、皂苷、多糖、类脂等成分。补骨脂素和异补骨脂素为香豆精类，在补骨脂中含量较高，故选取其作为定量指标控制本品的质量，采用高效液相色谱法测定其含量。

1 仪器、试剂与样品

LC-10ATVP高效液相色谱仪;SPD-10AVP紫外检测器;威玛龙色谱数据工作站。

补骨脂素、异补骨脂素对照品(中国药品生物制品检定所，供含量测定用);老年咳喘片及缺补骨脂的阴性对照样品由某药厂提供;甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验 色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶柱 (Kromasil C18 5μm;250mm×4.6mm)，流动相:甲醇 -水 (55∶45);流速:1.0mL/min;检测波长:246nm;柱温 :30℃;进样量 :10mL;理论板数按补骨脂素、异补骨脂素峰计算应不少于 4000，分离度应不小于 1.5。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取补骨脂素、异补骨脂素对照品适量，加甲醇制成每 1mL各含 20μg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取本品 10片，除去包衣，精密称定，研细，取粉末约 2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 20mL，密塞，称定重量，超声处理(功率 160W，频率 50kHz)40min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，取续滤液，即得。

2.4 阴性对照溶液的制备 依照“2.3项”下方法制备阴性对照溶液。

2.5 空白试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各 10μL，分别注入液相色谱仪，在“2.1”色谱条件下测定，在老年咳喘片供试品色谱图中，在与对照品色谱相应位置 (补骨脂素 tR=12.1min，异补骨脂素 tR=14.5min)上，确认了补骨脂素和异补骨脂素的吸收峰，而阴性对照溶液无补骨脂素和异补骨脂素的吸收峰，故认为无干扰。

2.6 线性关系考察试验 取补骨脂素对照品约9.4mg，异补骨脂素对照品约 9.2mg，精密称定，置同一100mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。精密吸取以上对照品溶液 0.5、1、2、5、10mL，分别置 10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取溶液各 10μL，注入液相色谱仪进行测定。以对照品进样量(mg)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线。结果表明补骨脂素在 0.0470～0.9400mg范围内时，进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系;异补骨脂素在0.0460～0.9200mg范围内时，异补骨脂素进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系。回归方程为:

补骨脂素:Y=7.1211×106X+5.1969×103(r=0.9999)

异补骨脂素:Y=7.1589×106X+5.1495×103(r=0.9999)

2.7 精密度试验 取一批样品，按“2.3项”方法制备供试品溶液 1份，按“2.1项”下色谱条件，连续测定 5次，计算含量。结果表明 5次测定结果的平均值为0.2503mg/g，RSD为 0.45%(n=5)。试验表明，本法的精密度良好。

2.8 重复性试验 取同一批样品(批号:060406)，按“2.3项”方法制备供试品溶液 5份，再按“2.1项”下色谱条件平行测定，5份测定结果的平均值为25.25mg/片 ，RSD为 0.31%(n=5)。结果表明，本法的重复性良好。

2.9 耐用性试验 取“2.7项”下供试品溶液用两根不同厂家同类型色谱柱分别以流速为 0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min进行测定。5份测定结果的平均值为 0.2658mg/g，RSD为 0.44%(n=5)。结果表明，本法的耐用性良好。

2.10 稳定性试验 对同一份供试品溶液(批号:051006)，分别在 0、1、2、4、6、12h测定次，共测定 6次，结果 6次测定结果平均含量为 0.2422mg/g，RSD为1.65%(n=6)。试验表明，在 12h内，供试品溶液稳定。

2.11 回收率试验 取补骨脂素 6.0mg，补骨脂素5.8mg，精密称定，置 50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为加样回收率试验用对照品溶液(每1mL含补骨脂素对照品 0.1200mg/mL，含异补骨脂素0.1160mg/mL，含补骨脂素、异补骨脂素总量0.23600mg/mL)。精密称取重复性试验项下的样品(含补骨脂素和异补骨脂素总量为 0.2506mg/mL)1.0g，共取 5份样，分别精密加入上述对照品溶液1mL，再加甲醇 19mL，按 “2.3项”制备供试品溶液，测定，计算回收率。结果平均回收率为 98.88%，RSD为1.66%(n=5)，结果表明回收率良好。见表 1。

表1 回收率试验结果(n=5)

2.12 样品测定及含量限度的拟订 按正文拟订的含量测定方法，测定了本品 10批样品中的补骨脂素、异补骨脂素含量，结果表 2。10批样品中批号为 060401含量最高，为 80.05μg/片;批号为 060304含量最低，为 57.62μg/片;10批样品平均含量为 73.44μg/片。在拟订含量限度时，根据 10批样品中含量测定结果的平均值，适当降低，故拟订本品每片含补骨脂以补骨脂素(C11H6O3)和异补骨脂素(C11H6O3)计，总量不得少于 60μg。

表2 样品中补骨脂素和异补骨脂素含量测定结果(n=10)

3 讨论

3.1 色谱柱的选择 参照《中国药典》2005年版一部中“补骨脂”【含量测定】项[1]所使用的色谱柱填料，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，经试验，达到分离测定的目的。

3.2 流动相的选择 参照《中国药典》2005年版一部中“补骨脂”【含量测定】项[1]所使用的流动相，采用甲醇 -水(55∶45)为流动相进行分析，达到分离测定的目的，所以选择甲醇 -水(55∶45)为流动相。

3.3 提取溶剂及条件的选择 由于补骨脂素、异补骨脂素易溶于甲醇、乙醇等溶剂，参照《中国药典》2005年版一部中“补骨脂”【含量测定】项[1]供试品制备提取溶剂及提取方法，所以用甲醇作为溶剂超声处理，可达到完全提取的目的。

3.4 提取时间的选择 经反复试验，超声提取 40min已能够提取完全。

3.5 测定波长的选择 取补骨脂素、异补骨脂素对照品适量，分别加流动相使溶解，在紫外分光光度计上扫描，结果补骨脂素对照品在 246.2nm波长处有最大吸收，异补骨脂素对照品在 246.4nm波长处有最大吸收，故选择 246nm为测定波长。

[1]中国药典[S].一部，2005:129-130.