曹火仁，顾晓峰，朱 骏 ，沈林辉，孙文梅，曹向英

（1.上海市松江区动物疫病预防控制中心，上海 201611；2.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；3.上海市松江区食用农产品安全监督检测中心，上海 201611）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）又称猪蓝耳病，是由PRRSV引起的一种严重危害养猪业的传染病。近年来，我国南方大部分地区在高温高湿季节发生的猪“无名高热病”，经研究证实主要是由高致病性猪蓝耳病病毒（猪繁殖与呼吸综合征病毒）变异株引起的。由于当前的疫苗并不能提供完全有效的保护，因此，加强对高致病性猪蓝耳病的监控对该病防制具有重要意义。为了了解松江地区高致病性猪蓝耳病的隐性感染状况，我们开展了高致病性猪蓝耳病的实时荧光定量PCR检测。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备 ABI Prism 7500荧光PCR仪、SIGMA高速冷冻离心机、生物安全柜。

1.2 试剂 高致病性猪蓝耳病实时荧光RT-PCR检测试剂盒；病毒RNA提取试剂盒。

1.3 试验材料 来源于松江区10个规模化猪场及8个生猪重点养殖地区的脾、淋巴结等组织病料以及血液样品。

1.4 操作方法

1.4.1 样本前处理 血液样品经8000 r/min离心2min，取血清100μL加入300μL变性液混匀；组织样品取0.5g加入1.5mL pH 7.2的PBS，研磨匀浆后，8000r/min离心2 min，取上清液100 μL加入300 μL变性液混匀。

1.4.2 模板制备 取若干个1.5 mL经DEPC水处理的灭菌离心管，加入已处理样品 30μL，醋酸钠溶液30μL，酚-氯仿-异戊醇液 300μL，颠倒 10次后，冰浴15min，4℃ 12000r/min 离心 15min，取 300μL上清液。再加入300μL异丙醇液混匀，置液氮中3min或-70℃冰箱中30min，取出，室温溶化后，经4℃ 15000r/min离心20min后弃上清，缓缓滴入1mL 75%乙醇，旋转一周后倒掉并倒扣于吸水纸上1 min，真空抽干15 min，加入10μL灭菌去离子水与RNA酶抑制剂混合液，-20℃储存备用。……