武汉工业学院动物营养与饲料科学湖北省重点实验室 韩 杰 刘玉兰* 洪 宇 吴志锋

在猪的生产中，免疫系统发育不完善、断奶应激、大量接触病原微生物等因素易导致断奶仔猪发生免疫抑制（袁书林，2006），从而降低其生长性能，增加其疾病易感性和死亡率。目前，环磷酰胺（CY）是各种免疫抑制药物中作用最强、应用最广泛的药物之一。大量动物试验证明，CY可抑制机体免疫功能（He等，2007； 赵戈清等，2005；El-Abasy等，2004）。但是，由于CY的药理功效复杂，对不同动物的毒作用剂量、毒作用点和毒作用程度均不同，且在猪上的模型较少，本试验用CY构造仔猪免疫抑制模型，从细胞免疫、体液免疫、细胞因子释放等方面观察了仔猪免疫功能的变化，旨在为仔猪免疫增强剂的研究和开发提供基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 CY为苏州尤利特生物医药科技有限公司产品，纯度 ≥99.3%；辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG、刀豆蛋白A（Con A）、四甲基偶氮唑盐（MTT）、植物血凝素（PHA）、卵清蛋白（OVA）均为Sigma产品；RPMI-1640培养基为Hyclone产品；淋巴细胞分层液为中国医学科学院生物工程研究所产品；胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；牛血清白蛋白（BSA）为Roche产品；四甲基联苯胺（TMB）为北京博奥森生物技术有限公司产品。

1.2 试验动物与试验设计 选用12头（28±3）d的杜×长×大断奶仔猪，预试1周，按完全随机区组设计将其分为对照组和CY组，每个处理6个重复，每个重复1头猪。试验期14 d。第1天和第7天，给CY组仔猪注射50 mg/kg BW的CY，对照组仔猪注射等量的生理盐水。另外，第1天所有仔猪从耳后肌肉注射BSA（终浓度1 mg/kg BW）。参照NRC（1998）断奶仔猪的营养需要配制基础日粮，日粮组成及营养水平见表1。

表1 日粮组成及营养水平

1.3 血液样品采集 于试验的第7天和第14天，从仔猪的前腔静脉采血：用非抗凝真空管采血，3500 r/min离心10 min后，分离血清，测定血清BSA抗体、IgG及细胞因子含量；用EDTA K3抗凝采血管采血1 mL用于白细胞分类计数；用肝素抗凝真空管采血7 mL，测定外周血淋巴细胞转化率。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 白细胞分类计数的测定 血液白细胞含量及其分类计数采用日本Sysmex K4500血液自动分析仪测定。

1.4.2 细胞免疫的测定 通过测定迟发型超敏反应和外周血淋巴细胞转化率来反映仔猪细胞免疫功能。

1.4.2.1 外周血淋巴细胞转化率 从仔猪前腔静脉用肝素抗凝真空管采血7 mL。取10 mL离心管加淋巴细胞分层液4 mL，然后沿管壁缓缓叠加血3 mL，2500 r/min离心30 min，取中间白细胞部分， 用3～5倍体积无 Ca2+、Mg2+Hank’s液洗 3次，每次2000 r/min离心10 min。然后将细胞悬浮于RPMI-1640完全培养液，用台盼蓝染色计数活细胞数（＞95%），调整细胞浓度为 2×106个/mL。然后将淋巴细胞悬液加入96孔细胞培养板中，加入Con A（终浓度为8 μg/mL）；另一组加入等体积的培养液为对照，培养体系为每孔200 μL。置5%CO2、37℃培养 72 h。在培养结束前 6 h，每孔加入10 mL MTT（初始浓度为5 mg/mL），继续培养。培养结束后，每孔加入100 μL 10%SDS-0.04 mol/L HCl溶液，继续培养2 h，使紫色结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪在570 nm下测定OD值。

1.4.2.2 迟发型超敏反应 参照Kornegy等（1989）的方法，在仔猪左腿内侧距最后乳头5 cm及距腹中线5 cm处皮下注射0.1 mL PHA（150 μg/0.1 mL），右侧对称部位注射等量的生理盐水，24 h后用游标卡尺测定双侧注射部位皮褶厚度的变化。

1.4.3 体液免疫的测定 通过测定血清免疫球蛋白G（IgG）和BSA抗体水平来反映仔猪体液免疫功能。

IgG水平用免疫比浊法测定，严格按照试剂盒（北京华英生物技术研究所产品）说明书进行。

BSA抗体水平用酶联免疫吸附法（ELISA）测定的操作程序进行：BSA抗原用碳酸盐缓冲液（pH 9.6）稀释至 10 μg/mL，包被酶标板，每孔100 μL，4 ℃过夜，洗涤液（0.01 mol/L pH 7.2 的磷酸盐缓冲液中加0.05% 吐温20）洗板3次，然后每孔加封闭液（PBS中加 0.03%OVA）200 μL，37℃封闭2 h。洗板3次后，将稀释好的血清（1∶80）加入酶标板中，每孔100 μL，每个样品3个重复，另取阴性血清稀释后作负对照，37℃温育1 h。洗板3次，加入1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG，每孔100 μL室温下反应1 h。洗板3次后，每孔加入100 μL新配制的TMB底物显色液，室温下反应15 min。显色反应结束时，每孔中加入50 μL 2 mol/L硫酸终止反应，用酶标仪在450 nm处测定OD值。

1.4.4 细胞因子的测定 干扰素-γ（IFN-γ）采用猪的ELISA试剂盒（R&D Systems Inc.）方法测定；白细胞介素2（IL-2）采用猪的ELISA试剂盒方法（Uscnlife Science and Technology Co.）测定。

1.5 数据统计分析 采用SPSS 13.0统计软件进行t-检验分析CY组和对照组之间的差异，P<0.05表示差异显著，P<0.10表示具有显著性趋势。

2 结果与分析

2.1 白细胞分类计数 由表2可知，CY显著降低第14天断奶仔猪的白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞数量（P<0.05），并且具有降低第7天嗜中性粒细胞和第14天单核细胞数量的趋势（P<0.10）。

表2 环磷酰胺刺激对断奶仔猪白细胞分类计数的影响

2.2 细胞免疫 由表3可知，CY对Con A诱导的淋巴细胞转化率和PHA刺激的皮褶厚度无显著影响。

表3 环磷酰胺刺激对断奶仔猪细胞免疫的影响

2.3 体液免疫 由表4可知，CY对IgG和第7天断奶仔猪的BSA抗体水平无影响，但显著降低了第14天BSA抗体水平（P<0.05）。

表4 环磷酰胺刺激对断奶仔猪体液免疫的影响

2.4 细胞因子 由表5可知，CY对IL-2及第14天的IFN-γ水平无影响，但显著降低第7天的IFN-γ 水平（P<0.05）。

表5 环磷酰胺刺激对断奶仔猪细胞因子的影响

3 讨论

CY是一种烷化剂，临床上主要用于治疗肿瘤自身免疫性疾病和器官移植等，其在体外无活性，进入体内，可在肝微粒体酶的作用下，分解出烷化作用很强的氯乙基磷酞胺，并与细胞内DNA交练结合，通过与DNA双链交叉连接破坏DNA，从而破坏免疫活性细胞，抑制细胞的增殖，具有较强的免疫抑制作用。因此，研究上常用大剂量的CY来构建动物免疫抑制模型（许爱华等，2008；董晓芳等，2007；He等，2007）。

当机体发生炎症或其他疾病时都可引起白细胞总数及各种白细胞的百分比发生变化。因此，白细胞分类计数是反映猪的免疫状况的常用指标之一（Tan等，2009）。本试验中，CY可降低第7天的中性粒细胞数及第14天的白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞数，表明仔猪的免疫功能受到一定程度的抑制。这与孙月平等（1999）、王盛民等（2006）、张炳华和刘新军（2008）的研究结果类似。

本试验中，从迟发型超敏反应和淋巴细胞转化率这两个指标可以看出，CY对细胞免疫功能无显著影响，这与袁书林（2006）、Hou 等（2007）和陈庆（2008）的结果不一致。这可能与试验设计、试验动物种类和健康状况、试验动物自身细胞免疫功能水平、CY的注射剂量及注射方式等不同有关。

BSA为一种异源蛋白抗原，具有胸腺依赖性，其抗体产生需要Th细胞的协助。免疫前仔猪血清中BSA抗体水平应为零，在经过抗原BSA刺激后，机体的免疫系统被激活，更多的蛋白质用于抗体的合成，抗体水平升高。本试验中，CY显著降低了第14天BSA抗体水平，这与He等（2007）的结果一致，表明CY抑制了仔猪的体液免疫功能。

根据细胞因子产生的不同，CD4+的Th细胞可分为Th1和Th2亚群。Th1分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，提升机体免疫效应；Th2分泌IL-4、IL-10等细胞因子，参与免疫抑制或免疫耐受（Raymond和 Wilkie，2004）。 在体内，Th1 和 Th2 以及相应的细胞因子含量的变化往往意味着机体免疫状态的变化，Th1及IL-2、IFN-γ等细胞因子的增加意味着机体免疫上调，Th2及IL-4、IL-10等因子的增加往往意味着免疫耐受或免疫下调（Ichiyama等，2006）。本试验发现，CY可降低第7天的IFN-γ水平，这与何荣（2005）与彭广华（2007）的报道一致。该结果提示：CY可抑制仔猪体内同源淋巴细胞活化，诱导分泌IFN-γ等细胞免疫上调因子的Th1减少，意味着机体免疫水平受到抑制。

4 小结

本试验表明，CY降低了断奶仔猪白细胞、单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞数量及BSA抗体和IFN-γ水平，使其免疫功能受到一定程度的抑制，但其对迟发型超敏反应和淋巴细胞转化率无影响。有关CY对断奶仔猪细胞免疫功能的影响仍需要进一步研究，进而确定CY最佳剂量和注射方式。

[1]陈庆.“芪苓”制剂对免疫抑制小鼠作用机理的研究：[硕士学位论文][D].福州：福建农林大学，2008.

[2]董晓芳，汪仕奎，萨仁娜，等.免疫抑制剂环磷酰胺对肉仔鸡生产性能及其内分泌的影响[J].畜牧兽医学报，2007，38（9）：993 ～998.

[3]何荣.益气清瘟片对免疫低下小鼠T细胞亚群和IL-2、IFN-γ影响的实验研究：[硕士学位论文][D].济南：山东中医药大学，2005.

[4]彭广华.从Th1/Th2漂移探讨千佛菌对环磷酰胺模型小鼠的免疫调节作用：[硕士学位论文][D].咸阳：陕西中医学院，2007.

[5]孙月平，王金宝，张乐萃，等.黄芪多糖对免疫抑制鸡某些免疫指标影响的研究[J].莱阳农学院学报，1999，16（1）：61 ～63.

[6]王盛民，侯新江，张瑛.膨化麦冬对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影响[J].陕西中医，2006，27（3）：368 ～370.

[7]许爱华，任莉，郑媛媛，等.银杏外种皮多糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠免疫反应的调节作用[J].中国药理学与毒理学杂志，2008，22（1）：69～72.

[8]袁书林.黄芪多糖对断奶仔猪免疫调控作用及其机理：[博士学位论文][D].北京：中国农业大学，2006.

[9]张炳华，刘新军.青春双歧杆菌对环磷酰胺免疫抑制小鼠的免疫功能的影响[J].中国现代医学杂志，2008，18（2）：153 ～156.

[10]赵戈清，罗霞，陈东辉，等.不同剂量环磷酰胺诱导正常小鼠免疫抑制的对比研究[J].免疫学杂志，2005，21（3）：122 ～124.

[11]El-Abasy M，Motobu M，Nakamura K，et al.Preventive and therapeutic effects of sugar cane extract on cyclophosphamide-induced immunosuppression in chickens[J].Int Immunopharmacol，2004，4：983 ～990.

[12]He X，Yang X J，Guo Y M.Effects of different dietary oil sources on immune function in cyclophosphamide immunosuppressed chickens[J].Anim Feed Sci Tech，2007，139：186 ～200.

[13]Hou F X，Yang H F，Yao T，et al.The immunosuppressive effects of 10 mg/kg cyclophosphamide in Wistar rats[J].Environ Toxicol Pharmacol，2007，24：30 ～36.

[14]Ichiyama T，Siba P，Suarkia D，et al.Analysis of serum and cerebrospinal fluid cytokine levels in subacute scierosing panencephalitis in Papua New Guinea[J].Cytokine，2006，33（1）：17 ～20.

[15]Kornegay E T，van Heugten P H G，Lindemann M D，et al.Effects of biotin and high copper levels on performance and immune response of weanling pigs[J].J Anim Sci，1989，67：1471 ～1477.

[16]NRC.Nutrient Requirements of Swine[M].10th Ed，National Academic Press，Washington D C，1998.

[17]Raymond C R，Wilkie B N.Th-1/Th-2 type cytokine profiles of pig T-cells cultured with antigen-treated monocyte-derved dendritic cells[J].Vaccine，2004，22：1016 ～1023.

[18]Tan B E，Li X G，Kong X F，et al.Dietary L-arginine supplementation enhances the immune status in early-weaned piglets[J].Amino Acids，2009，37（2）：323 ～331.