吴慧颖 张英杰

(商丘市人民医院 河南 商丘 472000)

目前,冠心病依然是威胁人类生命的头号杀手,缺血再灌注损伤成为阻碍缺血再灌注心肌从再灌注策略中获得最佳疗效的主要难题[1]。而抑制细胞凋亡能够有效的抑制再灌注损伤[2]。已有的实验和临床研究证明,缺血预处理能够减少心肌细胞凋亡,进而减轻心肌缺血再灌注损伤。由于患者发生缺血的时间无法预测,预处理在临床应用中受到限制。苯那普利是血管紧张素转换酶抑制剂第二代长效制剂,其通过抑制AngⅡ的生物学效应,对缺血再灌注心肌起保护作用[3]。本研究采用Langendorff离体灌注模型,观察苯那普利后处理对大鼠心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

250～300g雄性SD大鼠32只(辽宁医学院实验动物中心提供),苯那普利纯品(北京诺华制药公司提供),核因子-κB免疫组化试剂盒(武汉博士德生物有限公司)。TUNEL试剂盒(武汉博士德公司分装)。

1.2 方法

1.2.1 离体心脏缺血再灌注灌流模型建立[4]术前30min大鼠腹腔注射肝素(1000U/kg),3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉后迅速开胸取心,主动脉插管悬挂于Langendorff灌流装置上,灌流液为95%O2+5%CO2饱和的Krebs-Hanselet(KH)磷酸缓冲液,灌流压70cmH2O,温度稳定在37℃。主动脉插管夹闭30min停止灌流,放开60min恢复灌流建立I/R模型。实验分组:随机等分为4组。对照组:KH液持续灌流110min。缺血再灌注组:KH液稳灌20min,停灌30min,再灌60min。缺血预处理组:KH液稳灌20min,连续3次停灌3min/复灌5min,停灌30min后再灌60min。苯那普利后处理组:KH液稳灌20min,停灌30min,加入苯那普利(10～6mol/L)的KH液再灌15min,单纯KH液再灌45min。

1.2.2 心肌损害病理学观察 应用改良的Gonori变色酸亮绿特殊染色法(GCA)观察I/R后心肌病理形态学改变。于试验终点,速取左心室心尖部心肌,置于10%中性福尔马林液中固定,制作石蜡切片。脱蜡至水,天青石蓝及明矾苏木素液先后重复染核,水洗、分化反蓝,变色酸2R液及亮绿乙醇液重复染浆,脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。结果判定,正常心肌纤维GCA染色呈绿色,红细胞呈红色或橘红色,细胞核呈深蓝色,心肌纤维呈深红色为阳性。应用北京大恒图像分析系统,在光镜下每张切片任选10个视野(×400),分析并计算深红色面积占整个视野的百分比。

1.2.3 心肌组织NF-κB免疫组织化学染色 试验结束,速取左室心尖相同部位的心肌,置于10%的中性福尔马林溶液中固定,制作石蜡切片,脱腊,加入兔抗大鼠NF-κB多克隆抗体(1:100),4℃过夜,加入生物素化羊抗兔IgG,按照ABC法试剂盒操作,以PBS替代一抗作为空白对照,DAB显色,苏木精复染,常规脱水透明封片。结果判定:NF-κB免疫组织化学染色以心肌细胞核出现黄色或棕黄色颗粒为阳性。应用北京大恒图像分析系统,在光镜下每张切片任意选取10个视野(×400),分析并计数NF-κB阳性表达细胞占整个视野的百分比。

1.2.4 心肌细胞凋亡率的测定 采用DNA原位末端缺口标记技术(TUNEL法)测定凋亡细胞。试验结束,速取左室心尖相同部位的心肌,置于10%的中性福尔马林溶液中固定,制作石蜡切片,按试剂盒说明行DNA原位末端缺口标记,DAB显色,苏木精复染。以未加末端脱氧核糖核酸转移酶的标记溶液替换TUNEL混合液作阴性对照。凋亡细胞的细胞核被染成棕黄色或棕褐色,正常心肌细胞核被复染成蓝色。在高倍镜下(400×)观察,根据凋亡阳性细胞分布情况,于凋亡阳性区域随机选择l0个视野,计数心肌细胞凋亡指数,即心肌凋亡阳性细胞数占总细胞数的百分比,以此反应凋亡程度。

1.2.5 统计学处理 用SPSS 12.0统计软件进行分析,计量资料用表示,组间比较采用单因素方差分析,2组间比较用LSD检验。以P<0.05为差异有显著性,以P<0.01为差异有非常显著性。

2 结果

2.1 苯那普利后处理对缺血再灌注心肌损伤的影响

与对照组相比,I/R组心肌损害程度明显增加(P<0.01),预处理组、苯那普利后处理组阳性面积增加(P<0.05);与I/R组相比,预处理组、苯那普利后处理组阳性面积缩小(P<0.01);苯那普利后处理组与预处理组2组间比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.2 苯那普利后处理对NF-κB表达的影响

NF-κB阳性表达呈棕黄色颗粒,主要在胞核。NF-κB阳性表达百分率对照组为(10.98±3.65)%,I/R组NF-κB为(49.35±9.74)%,预处理组为(33.53±12.19)%,苯那普利后处理组为(34.77±4.66)%。与对照组相比,I/R组NF-κB阳性表达百分率显著升高(P<0.01);与I/R组相比,预处理组、苯那普利后处理组均下调,差异有统计学意义(P<0.01);苯那普利后处理组与预处理组比较,阳性表达百分率无统计学意义(P>0.05)。

表1 苯那普利后处理对缺血再灌注心肌损伤的影响(,n=8)

表1 苯那普利后处理对缺血再灌注心肌损伤的影响(,n=8)

注:与对照组相比★P<0.01,◆P<0.05;与I/R组相比▲P<0.01

2.3 苯那普利后处理对凋亡指数的影响

凋亡细胞的细胞核被染成棕黄色或棕褐色,正常心肌细胞核被复染成蓝色。凋亡指数对照组为(5.81±1.43)%,I/R组为(18.51±2.52)%,预处理组为(13.52±2.31)%;苯那普利后处理组为(13.03±1.74)%。与对照组相比,I/R组 凋亡指数显著升高(P<0.01);与I/R组相比,预处理组、苯那普利后处理组均下调,差异有显著性(P<0.01);苯那普利后处理组与预处理组比较,凋亡指数无显著性差异(P>0.05)。

3 讨论

本研究结果显示:与对照组相比,缺血再灌注组、缺血预处理组和苯那普利后处理组细胞凋亡率升高,心肌损伤程度加重;与缺血再灌注组比较,缺血预处理组和苯那普利后处理组细胞凋亡率明显减低,心肌损伤程度减轻,提示苯那普利后处理对缺血再灌注损伤心肌有保护作用。而苯那普利后处理组与缺血预处理组相比无明显差异,表明苯那普利后处理可诱导出预处理样心肌保护作用。

NF-κB是一种具有基因转录多向调控作用的转录因子。其亦存在于心肌细胞中,参与心肌缺血-再灌注导致的心肌的炎性反应、凋亡、坏死和心功能下降等心血管疾病的发生、发展[5]。本研究还发现,正常大鼠心肌组织有较少量的NF-κB表达,缺血再灌注60min后大鼠心肌组织中NF-κB的表达显著上调,细胞凋亡率明显升高,而苯那普利后处理组大鼠心肌在缺血再灌注60min组织中NF-κB表达则明显低于缺血再灌注组,细胞凋亡率也明显低于缺血再灌注组。因而推测苯那普利后处理具有减少心肌缺血再灌注后NF-κB的过度表达的作用,从而减轻心肌缺血再灌注后细胞凋亡的发生。具体中间机制尚有待进一步研究。

[1]Van Domburg RT,Sonnenschein K,Nieuwlaat R,et al.Sustained benefit 20 years after reperfusion therapy in acute myocardial infarction[J].J Am Coll Cardiol,2005,46(1):15～20.

[2]Zhao ZQ,Morris CD,Budde JM,et al.Inhibition of myocardial apoptosis reduces size and improves regional contractile dysfunction during reperfusion[J].Cardiovasc Res,2003,59(1):132～142.

[3]崔少波,刘仁光.苯那普利对离体大鼠缺血再灌注心肌的保护作用［J］.中国心血管杂志,2006,11(2):96～98.

[4]Curtis MJ,Macleod BA,Tabrizchi R.An improved perfusion apparatus for small animal hearts[J].1986,15:87～94.

[5]Jones WK,Brown M,Ren X,et al.NF-kappaB as an integrator of diverse signaling pathways:the heart of myocaedial signaling[J].Cardiovasc Toxicol,2003,3(3):229～254.