李海涛，苏磊，李国申

高压处理对西瓜生长及其品质的影响

李海涛1，苏磊2，李国申1

（1.河南大学生命科学学院，农业生物技术研究所，河南开封，475004；2.郑州轻工业学院物理系）

以西瓜为研究材料，利用高压装置，以水为传压介质，研究了静水高压（50 MPa，100 MPa，150 MPa）处理西瓜种子对成苗率、幼苗叶绿素含量、过氧化物酶活性和西瓜果实农艺性状的影响。结果显示，加压组（萌动种子和干种子）的成苗率下降，方差分析表明，两组西瓜种子的成苗率差异显著；加压组的叶绿素a、类胡萝卜素的含量均比对照组低，生长受到抑制；与对照组相比，加压组叶片的过氧化物酶活性明显增高，抗逆性增强，果实中心糖含量升高。总的来说，高压处理种子使西瓜前期生长受到抑制，后期有利于抗逆性增强、品质提高。

西瓜；高压；光合色素；过氧化物酶

高压生物学是近年来由高压物理学和生物学发展起来的一门交叉学科，由于分子生物学和高压物理学技术的不断深入和迅速发展，高压分子生物学已成为国际上研究的热点之一[1]。高压环境对于在常压下生长的生物来说是一种逆境，对植物能产生伤害甚至致死作用，生活中常用来进行（高压）灭菌和食品加工等。白成科等[2～3]利用静水高压处理水稻种子，发现高静水压能够影响水稻的生长发育，并能诱导水稻产生变异，认为静水高压处理对水稻来说是一种逆境胁迫，能够影响水稻一生的发育，从而使有效穗数和株高等主要农艺性状发生明显改变，而且筛选出稳定遗传的变异植株。苏磊等[4]高压处理大豆种子，不仅单株籽粒产量提高了30.6%，而且营养成分均朝着有利于提高品质的方向变化。

种子的萌发是植物一生中新陈代谢重新启动和生命开始的重要阶段，而有关高压处理种子对西瓜的成苗率、生长发育、产量品质的影响还未见报道。本研究利用静水高压（50 MPa，100 MPa，150 MPa，相同处理时间20 min）处理干西瓜种子、萌动西瓜种子，通过统计成苗率，跟踪调查其幼苗期的生长、叶片中叶绿素的含量及过氧化物酶的活性，以及对品质的影响，来探讨高压逆境锻炼对西瓜生长发育影响的规律和作用机制，为高压诱变育种提供更加全面和丰富的资料，以期进一步揭示高压诱变的生物学效应。

1 材料与方法

1.1 试验材料

西瓜（Citrullus lanatus）材料由河南大学农业生物技术研究所提供。选用不同类型的5个西瓜品种材料（纯合自交系）的种子：日本瓜（小型瓜），金小兰（小型瓜），郭牟（大型瓜），蜜玫绿（四倍体），金玫黑（四倍体）。

1.2 试验设计

每一品种随机分成7份，随机选用3份，用55℃水浸种搅拌，自然降温后浸种6 h，置于30℃恒温箱中催芽6 h（称为萌动），再分别用50 MPa、100 MPa、150 MPa静水压处理20 min；每个品种再随机选3份，分别用50 MPa、100 MPa、150 MPa静水压处理干种子20 min；最后1份种子作对照（CK）。种子处理后（2009年4月15日）立即用阳畦育苗，5月5日移植到大田地膜覆盖栽培，统一施肥浇水和田间管理。花期人工授粉，挂牌标记，根据不同品种成熟情况于7月上中旬采收。采摘后称质量，剖开，用手持糖量计测中心部位含糖量，每个材料重复3次（即测3个单瓜），保存种子。

1.3 试验方法

①成苗率的测定 将处理和对照种子于4月15日播种到培养钵内育苗，期间分3次统计出苗率，按幼苗生长较正常且长出真叶的植株统计成苗率。当苗长出2片真叶时，移栽入大田，常规水肥管理和病虫害防治。对处理当代即M1代，在开花期对植株进行套袋自交标记，果实成熟后进行单株考种。成苗率（%）=（成活的幼苗数/发芽试验的总粒数）×100%。

②光合色素含量的测定 分别于5月10日，22日摘取叶片进行光合色素含量测定，其测定方法如下。

a.取西瓜的新鲜叶片0.2 g，用水冲洗干净后剪碎放入研钵中，加入少量的石英砂和碳酸钙粉及95%的乙醇2.5 mL，研成匀浆，再加乙醇10 mL，继续研磨，至组织变白后静置3～5 min。

b.取滤纸一张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻璃棒把上述提取液倒入漏斗中，过滤到25 mL的棕色瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

c.用滴管吸取乙醇，将滤纸上的光合色素全部洗入容量瓶中，直至滤纸和残渣中无绿色为止。然后用乙醇定容至25 mL，摇匀。

在最初存放车辆时，可以根据用户预计的停车时长将车辆停放在不同位置，如果在预计的时间内取走车辆，则不会影响整个车库的运行效率，如果超过预计的停车时间没有取走车辆，无疑会影响车库的运行效率。因此，可以根据超过预计时间的长短将原来停放好的车辆的位置进行变动，将靠近出入口的车位留给接下来预存的车辆，以此来进一步提高车库运行效率。

d.把光合色素提取液倒入直径为1 cm的比色杯内，以95%的乙醇为空白，分别在665 nm、649 nm和470 nm的波长下测定吸光度，并根据吸光值计算光合色素含量，计算公式为：叶绿素a含量（Ca）=13.9A665-6.88A649；叶绿素b含量（Cb）=24.96A649-7.32A665；类胡萝卜素含量（Cx·c）=（1 000A470-2.05Ca-114.8Cb）/245。

③过氧化物酶活性的测定 5月22日取叶片进行过氧化物酶的测定，基本步骤如下。

a.取西瓜的新鲜叶片1 g，洗净、切碎后放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，并将其全部转入离心管中，于3 000 r/min离心10 min，上清液转入25 mL容量瓶中，沉淀用5 mL磷酸缓冲液再提取2次，上清液并入容量瓶中，定容至25 mL，低温下保存备用。

b.酶活性测定的反应体系包括：0.05 mol/L磷酸缓冲液2 mL；2%双氧水1.0 mL；0.05 mol/L愈创木酚1.0 mL和1 mL酶液。以加热煮沸5 min的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于34℃的水浴中保温3 min。后迅速稀释1倍，470 nm波长下比色，每隔1 min记录1次吸光度，共记录5次，然后以每1 min内470 nm波长处吸光度的变化为一个酶活单位来进行酶活计算，过氧化物酶活性=ΔA470×VT/（W×Vs×0.01×t），其中：ΔA470的吸光度为反应时间内吸光度的变化；W为材料的鲜质量；t为反应时间 （min）；VT为提取酶液的总体积（mL）；Vs为测定取用酶液的体积（mL）。

2 结果与分析

2.1 静水压对西瓜出苗率的影响

由图1可以看出：对于萌动种子，随着静水压压力的增大，出苗率均呈现出降低的趋势。与对照相比，50 MPa平均比对照降低12%，其中金小兰和郭牟这2种材料略高于对照；100 MPa静水压下，萌动种子的出苗率较对照低65.4%，略高于半致死剂量；在150 MPa静水压下，5个材料中仅1个材料出1棵苗，其余全部无苗。

对于干种子处理，出苗率随着压力的升高，不同品种类型之间差异较大，但整体呈降低趋势。2个四倍体品种（蜜玫绿和金玫黑）和1个小型品种（日本瓜）对于50 MPa、100 MPa、150 MPa三个静水压剂量反应都比较强烈，出苗率比对照低78.9%以上，金玫黑（四倍体）出现先急剧下降、后缓慢升高再下降的变化趋势；而有2个品种金小兰（小型瓜）和蜜玫绿（四倍体）处理压力在100～150 MPa时，出现成苗率升高之现象。

同一品种材料，在50 MPa、100 MPa静水压下，萌动的种子出苗率明显高于干种子，在压力50 MPa下时日本瓜萌动种子成苗率是干种子的19倍，而在150 MPa静水压下，干种子出苗率反而高于萌动的种子。

2.2 高压处理对西瓜叶片光合色素含量的影响

分别在播种后的第26天和第38天选取日本瓜和蜜玫绿材料的叶片，进行光合色素含量的测定。

经高静水压处理种子后，西瓜幼苗的光合色素含量因播种后天数不同而存在差异。高压处理日本瓜种子（图2），在播种26 d后，3种光合色素分别为对照的94.3%，93.6%，94.9%，播种38 d后，分别为对照的79.3%，97.2%，68.2%；而高压处理蜜玫绿种子（图3），在播种 26 d后，3种光合色素含量分别为对照的99.5%，104%，96.5%，播种38 d后，分别为对照的97.6%，123.5%，85.2%，随着播种天数的增加，处理组与对照的色素含量均在增加，而处理组 Ca和Cx.c含量分别与对照组相比，前者增幅小，后者增幅大，但Cb含量却是处理组比对照组增幅快。

2.3 高压处理对西瓜叶片过氧化物酶活性的影响

图1 高压处理对出苗率的影响

植物在逆境条件下出现的伤害或者植物对逆境的不同抵抗能力往往与体内POD活性水平有关。高压处理能增加西瓜材料过氧化物酶的活性，压力增大，过氧化物酶活性增强。与对照相比，高压处理（萌动100 MPa）日本瓜的过氧化物酶活性始终高于对照，最高时可达到对照的16倍左右。高压处理蜜玫绿（萌动50 MPa）的过氧化物酶的活性与对照相比前2 min明显高于对照，分别为对照的147%，115%，而后2 min则分别比对照低27.9%，5%。总体来看，高压处理对二倍体 （日本瓜）POD活性水平的影响显著高于四倍体（蜜玫绿）。

2.4 M1代植株的变化（异）类型

播种后不同时间进行出苗率统计可以看出经过静水压处理的西瓜种子出苗较为缓慢，且出苗率降低。移栽大田后，高压处理材料前期生长受到抑制，后期生长发育逐渐与对照相当，随后出现反超现象。处理的当代种子在大田种植过程中，从形态学观察，发现有各种变异类型。有利变异包括叶片颜色加深、茎蔓粗壮、果实变大、含糖量增加等；不利变异包括叶子形状发生畸变、生育期推迟晚熟、不易坐果、畸形果实出现等。对M1代，在开花期对植株进行套袋自交标记，果实成熟后进行单株考种，对其连续种植，观察突变或者变异是否能够遗传，从而筛选突变株系。

2.5 中心可溶性糖含量的变化

5个西瓜品种萌动和干种子在不同静水压50 MPa、100 MPa、150 MPa处理和对照中心糖含量变化如图4（由于萌动种子在150 MPa处理后没有成活植株，故没有萌动150 MPa的中心糖含量变化）。从图4可以明显看出，在郭牟、日本瓜、金枚黑、金小兰4个品种中，经过静水压处理，均出现了中心糖含量比对照增加，用SPSS软件方差分析，这4个品种的中心糖含量，高压处理与对照差异显著。特别是在金枚黑中，压力100 MPa处理萌动种子，中心糖含量增加10%左右。但是，蜜枚绿却出现了处理后中心糖含量下降的情况。

表2 西瓜处理组与对照组叶片的过氧化物酶活性比较

2 高压处理对日本瓜光合图色素的影响

图3 高压处理对蜜枚绿光合色素的影响

图4 高压处理对西瓜中心可溶性糖含量的影响

3 小结与讨论

西瓜种子的萌发、生长发育过程是一个复杂的合成-分解代谢过程，受多种物理、化学因素的影响。在梯度压力相同处理时间下，5个品种材料均因静水高压破坏程度不同或种子活力个体间存在差异，使部分种子失去活性不能发芽，部分种子却能逐渐修复静水高压的破环作用，最终发芽，前期生长发育受到抑制，后期逐渐赶上对照，且能结瓜留种。产生这一结果的原因可能与静水高压处理破坏了种子的细胞显微结构、膜结构、蛋白质的结构和组成有关。Whelch等[5]认为，静水高压处理对于生物细胞膜的流动性、透性以及细胞的纤维结构都有明显的影响甚至破坏作用。王宝山[6]认为，逆境胁迫对植物的生长抑制常常伴有细胞膜结构的破坏，主要由细胞内特别是线粒体或者叶绿体中产生的超氧自由基，·OH-，H2O2等）攻击膜脂而造成的。但植物体要减少自由基对其造成的伤害，因此同时存在着清除这些自由基的途径。一般情况下，植物体内自由基的产生和清除处于动态平衡状态。但处于逆境中时，这种平衡状态遭到破环，不能及时清除的活性氧使细胞内部出现氧化胁迫，进而引起生物大分子的氧化损伤和生物膜完整性的破环[7]。过氧化物酶存在于植物体内的过氧化物酶体中，是内源活性氧清除酶之一，它清除O2·-，生成H2O2，接着把后者水解成对植物体没有损害作用的H2O和O2，从而抑制膜脂过氧化，维持膜系统稳定性。高压100 MPa处理日本瓜的过氧化物酶的活性显著强于对照，高压50 MPa处理蜜玫绿的过氧化物酶的活性也明显高于对照，这说明高压处理后的植株抗氧化能力提高，抗逆性增强。

白成科等[8]认为，染色体加倍和外源基因的导入，可能与种子的耐压性降低和突变频率提高有关。而本文相同的高静水压处理条件对不同类型西瓜材料种子的成苗率影响不同，二倍体（金小兰和日本瓜）比四倍体（蜜玫绿和金玫黑）的成苗率高，而四倍体种子的耐压性低，这也与前人研究的结果基本一致。静水高压处理西瓜种子后，处理当代的部分品种在茎秆粗壮（蜜玫绿、金玫黑）、生育迟缓（金玫黑）、含糖量升高（郭牟、日本瓜、金枚黒、金小兰）等性状方面发生了显著变化，这表明静水高压能够影响西瓜一生的发育。静水高压处理对西瓜种子萌发来说是一种逆境胁迫，虽然从萌发期就解除了这种胁迫，但其影响却是一直维持到生育后期，从而使西瓜M1代的品质和农艺性状发生明显变化。对M1代变异或者变化植株，要严格自交，单株考种，以便在M2代进行观察研究M1代的变异是否是可遗传变异，进而筛选有利突变植株。

尽管高静水压诱导高等植物产生突变的工作已经在其他植物上开展了近10 a，但对于西瓜选育新品种的工作仍处于理论和实践的探索阶段，因此有必要进一步开展高静水压诱变机理的研究，为该方法在植物育种上的成功应用提供理论依据。本研究从选育新品种的角度出发，利用高静水压处理西瓜种子，处理当代群体能够出现一些变异性状，通过多代“优中选优”，筛选出综合性状优良的突变株系，它们具有株型较好、茎秆粗壮、早熟，能育成理化性质高、品质好的西瓜新品种。从作物育种的角度来看，高静水压处理有望成为西瓜诱变育种的新方法。

[1]Winter R.High pressure effects in molecular biophysics proceedings of the intermational school of physics"Enrico Fermi".Course CXL-VⅡ on high pressure phenomena Amsterdam：DS，2003:413-453.

[2]白成科，李桂双，段俊，等.高压处理后水稻抗氧化酶活性及对逆境胁迫的响应[J].高压物理学报，2005，19（3）：235-240.

[3]白成科，李桂双，彭长连，等.高静水压诱导水稻变异的初步研究[J].热带亚热带植物学报，2003，11（2）：132-136.

[4]苏磊，邵春光，贾茹，等.高压处理对大豆农艺性状、产量和品质的影响[J].大豆科学，2008，27（1）：101-104.

[5]Whelch T J，Farewell A，Neidhandt F C，et al.Stress response ofE Coli to elevated hydrostatic pressure [J].J Bacteriol,1993,175:7 170-7 177.

[6]王宝山.植物自由基与植物膜伤害[J].植物生理学通讯，1988（2）：12-16.

[7]Chia L S,McRae D C,Thompson J E.Light-Dependence of paraquat-initiated membrane deterioration in bean plant evidence for the involvement of surpreoxide[J].Physiologia Plantarun，1982，56：492-499.

[8]白成科，段俊.高静水压处理对四倍体和转基因水稻种子萌发的影响[J].种子，2007，26（6）：1-3.

Effects of High Hydrostatic Pressure Treatment on the Seedling Growth and Quality of Watermelon

LI Haitao1,SU Lei2,LI Guoshen1
(1.Institute of Agricultural Bio-technology,College of Life Science,Henan University,Kaifeng,Henan 475001; 2.Department of Physics,Zhengzhou University of Light Industry)

The effects of high hydrostatic pressure treatment(50 Mpa,100 Mpa,150 Mpa)on the planting percent,chlorophyll contents,peroxidase and quality of watermelon were studied.The results showed that the planting percent in treated group decreased in comparison to the control group and T-test indicated the difference is significant in the believable level of 95.The contents of chlorophyll and carotenoid in the treated group is less than that of the control group,while the activity of peroxidase and adversity resistance in the treated group is more than that of control group.It showed that high hydrostatic pressure treatment can inhibit the growth of watermelon at the early stage and enhance the adversity resistance and the quality of watermelon at the later stage.

Watermelon;High hydrostatic pressure;Photosynthetic pigment;Activity of peroxidedase

10.3865/j.issn.1001-3547.2010.10.016

河南省郑州市金水区科技项目（金科字[2008]18号），河南省教育厅攻关项目（2008A208002）

李海涛（1980-），男，在读硕士，研究方向为作物遗传育种，电话：13837813116，E-mail：shirenshan@163.com

李国申（1957-），男，通信作者，研究员，E-mail：lgs@henu.edu.cn

2010-04-21