李 杨,孙 莉,李晓文#,陈 辉

1)郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室郑州 450001 2)郑州大学第一附属医院检验科郑州 450052

#通讯作者,女,1955年生,本科,教授,研究方向:遗传病分子机制与基因诊断,E-mail:lixaowen@zzu.edu.cn

短串联重复序列(short tandem repeat,STR)的重复单位长2～6 bp,STR在整个人类基因组中分布广泛,目前是法医DNA分析中最常用的一类遗传标记[1]。在日常检案中,除常见的标准三联体和二联体鉴定外,有时因父母已故或因某种原因不能参与鉴定,当事人便会要求进行同胞兄弟间的血缘鉴定。作者将7个Y染色体STR(Y-STR)位点(DYS19、DYS385、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS390、A7.1和H4)和13个常用的常染色体STR位点(CSFIPO、TPOX、THOI、F13AOI、VWA、D16S539、D7S820、D13S317、 D18S51、D3S1358、D21S11、D8S1179和D5S818)联合运用于同胞兄弟鉴定,探讨其可行性以指导实践。

1 材料与方法

1.1 样本来源 随机抽取来自河南汉族不同家系的80对同胞(包括 34对兄弟)和 80对无关个体(包括51对男性无关个体)的外周血样各2mL,EDTA抗凝,-20℃保存。

1.2 DNA提取 常规苯酚-氯仿抽提法提取DNA。

1.3 PCR扩增及产物分离 所有检材(即80对同胞和80对无关个体)均扩增13个常染色体STR基因位点。34对兄弟和 51对男性无关个体扩增 7个Y-STR基因位点。常染色体复合位点扩增反应体系见表1,扩增条件:96℃预变性2min;94℃1 min, 60℃1min,70℃1.5min,共10个循环;以后90℃1 min,60℃1min,70℃1.5 min,共20个循环;最后60℃延伸30min,4℃保存。Y-STR位点扩增反应体系见表 2、表 3。DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ和DYS390扩增条件:94℃预变性3min;94℃15 s,58℃20 s,72℃20 s,共5个循环;94℃15 s,54℃20 s,72℃20 s,共30个循环;72℃延伸10min,4℃保存。A7.1和H4扩增条件:95℃预变性5 min;94℃45 s,61℃45 s,72℃45 s,共30个循环;72℃延伸5 min,4℃保存。DYS385扩增条件:94℃预变性3 min;94℃30 s,59℃30 s,72℃1 min,共2个循环;94℃30 s,57℃30 s,72℃1min,共2个循环; 94℃30 s,56℃30 s,72℃1min,共29个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。DYS19扩增条件:95℃预变性12min;94℃1min,60℃1m in,72℃1min (每个循环退火温度依次降低0.5℃);94℃1min, 56℃1min,72℃1min,共30个循环;72℃终延伸10min,4℃保存。Y-STR引物序列从STRBase(http://www.cstl.nist.gov/div831/strbase)查找,常染色体STR位点引物均来自基因组数据库。扩增产物用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染显示电泳结果,根据等位基因梯阶对照命名等位基因。

表1 常染色体STR复合扩增体系

表2 DYS390、DYS389Ⅰ/Ⅱ和A 7.1、H 4复合扩增体系

1.4 观测指标 计算7个Y-STR位点的单倍型多样性;用ITO法计算13个常染色体STR位点的同胞组和无关个体组的同胞关系指数(PIFS)[2],并按公式W=PI/(PI+1)分别计算同胞关系概率(WFS),式中 W为父权概率,PI为亲权指数[2-3];分析每对同胞在7个Y-STR位点和在常染色体STR位点等位基因的匹配情况。

表3 DYS19、DYS385复合扩增体系

1.5 同胞关系判断方法 以同胞组与无关个体组全相同基因数或全不同基因数无重叠为标准,即全相同数≥5或全不同数≤1提示为同胞关系,全不同数≥6或全相同数≤0提示为无关个体。

1.6 统计学处理 采用SPSS 10.0对常染色体STR位点等位基因匹配结果行两独立样本的秩和检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Y-STR位点的单倍型分析 34对兄弟的7个Y-STR基因位点均相同,51对无关男性个体中 2、3、4、5和 6个基因位点不同的个体对数分别为 2、5、13、14和 14例,7个基因位点全不同者 3例,7个 YSTR位点的单倍型多样性为0.999 233。同胞组中A6/B6与 A7/B7的单倍型完全一致,均为 11/12-13/12/29/23/11/11(表 4);非同胞组中单倍型 12/ 12-17/13/30/24/11/12出现 3次,单倍型 11/13-18/ 11/27/24/10/11出现 2次。

2.2 13个常染色体STR位点基因匹配结果 同胞组中13个常染色体STR位点PIFS值为0.049 6-1.667×108,WFS值为96.064%;无关个体组中13个常染色体STR位点PIFS值为6.143×10-6-3.535, WFS值为 3.544%。80对同胞与 80对无关个体 13个常染色体位点等位基因匹配结果见表 5。

2.3 同胞关系判断结果 以13个常用的常染色体STR位点检测 51对男性无关个体和 34对兄弟,同胞兄弟中有5对不能判断,分别为 A11/B11、A25/B25 (全相同基因数为 3,全不同基因数为 3),A20/B20、A30/B30(全相同基因数为 4,全不同基因数为 2), A24/B24(全相同基因数为 3,全不同基因数为 2)。在无关个体组中 15例不能判断,分别为全相同基因数为 1,全不同基因数为 4的 3例;全相同基因数为3,全不同基因数为 5的 3例;全相同基因数为2,全不同基因数为 4的 2例;全相同基因数为 3,全不同基因数为 3的2例;全相同基因数为 4,全不同基因数为3的 2例;全相同基因数为 2,全不同基因数为 5的 1例;全相同基因数为1,全不同基因数为3的1例;全相同基因数为 1,全不同基因数为 5的 1例。联合运用这 20个位点仅有 5对同胞不能确定。

表4 同胞兄弟7个Y-STR位点单倍型分析结果(n=80)

表5 13个常染色体STR位点等位基因匹配结果(n=80) 例

3 讨论

Y染色体序列结构稳定,除拟常染色质区外,大部分在减数分裂中不出现重组交换,因此以单倍型概率计算。作者选取了 7个常用的分布于拟常染色质区外的Y-STR位点,分析其在男性同胞鉴定中的应用价值。研究结果显示,7个Y-STR位点单倍型多样性为0.999 233。但值得注意的是,来自不同家系的同胞对(A6/B6与A7/B7)之间及无关个体之间都有相同单倍型出现,说明无血缘个体的7个Y-STR单倍型也可能完全相同。Y-STR位点是全男性遗传,较常染色体STR位点应用方便,但多态性普遍不太理想,一般在4～6个等位基因,因此,用较少的Y-STR位点进行亲缘关系鉴定有误判的可能。仅用常染色体STR鉴定同胞兄弟需要检测大量位点,作者以 13个常染色体STR位点检测34对同胞和51对无关个体,同胞组与无关个体组仍分别有 5对和 15对不能判断。联合运用这 20个位点仅有 5对同胞不能确定。

综上所述,当仅用常染色体或Y-STR位点鉴定同胞兄弟时,均有误判可能,如果将7个Y-STR位点和13个常染色体STR位点联合运用来鉴定同胞兄弟,则可大大增加判断率。该研究中 Y单倍型相同的无关个体之间及来自不同家系的同胞对(A6/ B6与A7/B7)之间,13个常染色体STR位点全不同位点数均≥6,或全相同数≤0,可以认定为无关个体。而13个常染色体STR位点不能判断的 5对同胞的7个Y-STR位点单倍体相同,提示可能具有同胞关系,但须增加检测的基因数目,从而进行确定; 15对无关个体中,7个Y-STR位点中不同基因位点数均≥2,可以确定为无关个体。

同时检测Y-STR和常染色体STR可有效提高鉴定率,效果远远好于仅用其中之一,而且省时省力,应用方便。在实际工作中应采用多少个基因位点可达到最佳效果,有待于进一步探讨。

[1]陆惠玲,刘秋玲,台云春,等.常染色体STR遗传标记在同胞鉴定中的应用[J].中国法医学杂志,2003,18(3): 154

[2]陆惠玲,杨庆恩.用 ITO法计算两个体间的血缘关系机会[J].中国法医学杂志,2002,17(3):188

[3]郑秀芬.法医DNA分析[M].北京:中国人民公安大学出版社,2002:102