崔 颖,梁剑平,王 玲,王曙阳,白卫兵,王学红,华兰英

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所新兽药工程重点开放实验室,甘肃 兰州 730050;2.兰州大学,甘肃 兰州 730000;3.甘肃农业大学动物医学院,甘肃 兰州 730070)

贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)是藤黄科(Clusiaceae)金丝桃属(Hypericum L.)植物贯叶连翘的全草,为多年生草本植物,具有抗菌消炎、收敛止血、消肿止痛等功效[1]。国外研究发现,金丝桃素(Hypericin)是贯叶连翘中最具生物活性的物质,其医用价值很高。临床上除了用于抗抑郁、抑制中枢神经作用外,还是一种有前途的内源性光敏剂,可用于肿瘤的光化学诊断与治疗。近年来的研究证明,金丝桃素有显著的抗DNA、RNA病毒作用,曾用于艾滋病的治疗。在德国金丝桃素已与白蛋白结合用于临床治疗艾滋病及甲型、乙型肝炎[2]。国内新近研究发现,金丝桃素对禽流感病毒和口蹄疫病毒均有较强的抑制作用[3-5]。

贯叶连翘主要分布在我国的华东、中南、西南和西北地区,资源相当丰富[6]。由于全草中所含金丝桃素仅有万分之几,只有通过化学方法对其进行提取、分离,才能达到国际市场对贯叶连翘提取物中金丝桃素含量须大于0.3%的要求。关于从贯叶连翘中提取金丝桃素的工艺研究,国外在1980年代已开始进行,国内直到1990年代末才有报道,现行工艺产品中金丝桃素的含量在0.3%～0.7%之间[7-8]。为了得到含量更高的金丝桃素提取物,用于药理和药效试验,笔者根据金丝桃素的理化特性,研究、筛选出一种成本低、操作简单的从贯叶连翘中提取、分离金丝桃素的工艺方法,结果得到了含量为0.914%和1.08%的2种产品。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 Waters高效液相色谱仪系列,510型泵,480型紫外检测器;557型HITACHI紫外-可见分光光度计;RE-52A型旋转蒸发仪;SHZ-Ⅲ型循环水真空泵;HHS21-N型电热恒温水浴锅;DMF-100型电动植物粉碎机。

1.2 药材与试剂 干燥贯叶连翘全草,购自甘肃省康县;金丝桃素标准品,购自美国 Sigma公司;乙醚、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、冰醋酸均为分析纯;色谱甲醇、乙腈均为色谱纯;水为双蒸水;薄层层析硅胶G(青岛海洋化工有限公司);LSA-20大孔吸附树脂(西安蓝深交换吸附材料有限责任公司);羧甲基纤维素钠(CMC)。

1.3 对照品溶液的制备 精密称取金丝桃素标准品1 mg于25mL棕色容量瓶中,加入无水乙醇使溶解,定容。置4℃冰箱保存备用。

1.4 薄层色谱分析 取适量薄层层析硅胶G,加入0.1%的CMC溶液,搅拌均匀,制成薄层板,自然晾干后,105℃活化1 h,置干燥器中备用。展开剂为石油醚-乙酸乙酯-甲醇(1∶4∶3)。在金丝桃素的提取、分离过程中用薄层色谱(TLC)法进行跟踪检查,具体方法为:将对照品溶液和样品溶液点于同一块薄层板上,用展开剂展开后置紫外灯(254 nm)下观察,金丝桃素显红色荧光斑点,Rf值为0.85。

1.5 金丝桃素的提取、分离与纯化

1.5.1 预处理 将干燥的贯叶连翘全草粉碎成粗粉,称取该粗粉1 kg,装入渗漉柱中,加入乙醚进行渗漉,从而除去贯叶连翘中的叶绿素等脂溶性杂质。渗漉速度为1～2mL/min。随着渗漉的进行,漉液的颜色由深绿色逐渐变浅,当接近无色时,表明叶绿素基本除去,停止渗漉。将药粉取出晾开,以挥发去乙醚,漉液通过旋转蒸发仪回收乙醚,重复利用。

1.5.2 金丝桃素的提取 将预处理过的贯叶连翘药粉装入三颈圆底烧瓶中,一个瓶口连接空气冷凝管,一个瓶口插入温度计。加入无水乙醇2000mL,59℃～60℃水浴温浸 2 h,过滤,滤液备用,滤渣中再次加入1000mL无水乙醇,同样条件下进行第2次温浸,过滤,取少量滤液作TLC检查,结果发现仍有金丝桃素,重复以上操作,至第9次时,T LC结果显示滤渣中已无金丝桃素。将前10次滤液合并,在旋转蒸发仪上55℃减压浓缩为浸膏Ⅰ。

1.5.3 金丝桃素的分离 将新树脂用95%以上的乙醇浸泡,充分搅动以除去气泡,静置过夜,湿法装入玻璃柱中。将浸膏Ⅰ用50mL无水乙醇溶解,过滤,滤液上LSA-20大孔吸附树脂柱,然后用无水乙醇洗脱,收集流出液,用TLC跟踪检测至流出液中无金丝桃素时,在旋转蒸发仪上55℃减压浓缩为浸膏Ⅱ。

1.5.4 金丝桃素的纯化 将薄层层析硅胶G干法装柱,尽量装得均匀、紧密,上面覆盖一层滤纸,取浸膏Ⅱ用30mL丙酮溶解,过滤,滤液上硅胶柱,用丙酮洗脱至色层完全展开后,层析柱由上至下显示出黄色、棕黄色、红色、棕红色、绿色等色带,掏出红色部分硅胶,装入小玻璃柱内用丙酮冲洗至硅胶无色,冲洗液浓缩干燥后,得红色浸膏Ⅲ。

1.6 金丝桃素的含量测定

1.6.1 标准溶液的制备 精密称取金丝桃素标准品1 mg于10mL棕色容量瓶中,加入甲醇使溶解,定容。置4℃冰箱保存备用。

1.6.2 检测波长的确定 用557型HITACHI紫外-可见分光光度计对标准溶液进行扫描(190～900 nm),出现多个吸收峰,取浸膏 Ⅱ,溶解后在218 nm和284 nm波长处检测,发现284 nm杂质峰较少,干扰小,所以确定284 nm作为检测波长。

1.6.3 色谱条件[9-10]Kromasil C18(5 μ m,250×4.6 mm)色谱柱;流动相为乙腈-水(140∶10,内含1%的冰醋酸),柱温30℃,流速1mL/min,检测波长284nm。

2 结果

2.1 经大孔吸附树脂分离得到的浸膏Ⅱ通过高效液相色谱法分析、测定,其金丝桃素的含量为0.914%。

2.2 大孔吸附树脂分离后又通过硅胶柱纯化得到的浸膏Ⅲ,经高效液相色谱法分析、测定,其金丝桃素的含量为1.08%。

3 讨论

3.1 叶绿素在贯叶连翘中的含量较高,如果不除去,对金丝桃素的分离、纯化带来很大干扰,笔者通过对氯仿、石油醚及乙醚的多次试验、检测,最终筛选出用乙醚渗漉法除去叶绿素,效果较好。

3.2 据文献报道[11],金丝桃素的TLC在紫外灯下显红色荧光,提示笔者在提取、分离时,采用T LC跟踪检测,薄层板上红色荧光斑点的消失可以作为终点的判断指标。

3.3 金丝桃素的化学性质非常不稳定,对光照、温度和空气中的氧极其敏感[12],所以在提取、分离、纯化过程中尽可能避免强光照射和高温环境,浓缩、干燥的温度控制在60℃以下,浸膏务必密封,冷藏保存。

[1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:上海科学技术出版社,1986:1488-1489.

[2]潘映红,郭宝林.国产金丝桃属植物有效成分研究概况[J].中药材,1993,16(8):40-42.

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[4]祝艳华,梁剑平,赵晓虹,等.金丝桃素蛋白络合物在鸡体内对H9N2亚型禽流感病毒杀灭效果的研究[J].中兽医医药杂志,2006(3):5-8.

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[7]李俊,莫琪,张健.乙醇法提取金丝桃素的研究[J].现代化工,1998,18(8):27-29.

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