董发明,邱 妍,王天奇,闫文朝

(河南科技大学动物科技学院,河南洛阳471003)

目前,饲料添加剂的研究和开发虽已取得了一定的进展,且在提高畜禽生产性能和疾病控制等方面取得了一定的效果,但随着对中草药饲料添加剂研究的深入,发现仍然存在着一些问题[1],如:科技含量低,传统应用多为草药直接粉碎,添加量大,作用效果不稳定;单胃动物对粗纤维的消化能力有限,而中草药多为植物的茎、根、皮,粗纤维含量很高,有效成分包含于植物中,而细胞壁也多为粗纤维构成,单胃动物多不能破坏细胞壁,有效成分就不能很好的发挥,因此产品科技含量不高制约着它向更高层次的发展;对中草药饲料添加剂机理的研究大多仍沿用传统的中医理论,并且一般只限于畜禽效果方面的研究,而缺乏判定效果的客观指标,没有深入到中草药添加剂有效成分的作用机理,难以形成普遍认可的产品。因此,我们在中国传统中医中药理论的指导下,选用紫河车、黄芪、白术、苍术等药物,采用先进的超微粉碎技术,将中药破壁,使有效成分析出,按不同的比例组合成超微粉饲料添加剂,添加到断奶仔猪饲料中,观察其对仔猪外周血淋巴细胞免疫功能的影响,旨在探讨中药提高机体抗病力的作用机理,为中药超微粉饲料添加剂的临床推广应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 中药 紫河车(人胎盘)、黄芪、麸炒白术、炒苍术:购自洛阳市医药公司;牛胎盘:自洛阳巨尔乳业公司奶牛场收集足月正常分娩牛胎盘,除去羊膜及脐带,反复冲洗至去净血液,在沸水中略煮后,切碎烘干研面备用。

1.2 试验动物及分组 洛阳市精达种猪场,使用出生时间相近的90头体重10 kg左右的“杜长大”三元杂交断奶仔猪作为试验猪,根据体重相近、公母各半的原则将其分为对照组(不加药)、试验Ⅰ组(加0.5%中草药超微粉1),试验Ⅱ组(加0.5%中草药超微粉2),每组30头。猪日喂4次,采用干拌料,自由饮水。预试期7 d,预试期间对试验猪进行驱虫及防疫。正试期25d,正试期间记录每日采食量和猪群的情况,对患病仔猪给予一定治疗。正试结束后,于早晨空腹称重,每组随机选4头仔猪,耳静脉采血4 mL备用。

1.3 供饲日粮 参照我国断奶仔猪的饲养标准,按照营养需要配制成全价日粮。

1.4 试验药品 淋巴细胞分离液,购自天津灏洋生物制品科技有限公司,批号:20070602;副品红等,上海试剂三厂,批号:070207。

4%鸡红细胞悬液的制备:鸡翼下静脉采血,肝素抗凝,Hank′s液洗涤 3次,末次洗后,将压积红细胞,用Hank′s液配成4%鸡红细胞悬液,4℃冰箱保存备用。

抗鸡红细胞抗体的制备:选体重3 kg以上的健康家兔,用Hank′s液洗过的压积鸡红细胞进行免疫,每日背部皮下注射1次,连续5 d,注射量分别为0.5、1.0、1.5 、2.0 、2.5 mL;然后改用静脉注射 50%压积红细胞悬液1 mL,1日1次,连续3 d。末次注射后7 d采血,测定红细胞的凝集效价,以出现“凝集”的最高抗血清稀释度判定为血凝效价。效价达1∶2 000以上者为合格。应用时采用凝集价的1/2(亚凝集价)作为抗血清的稀释度(即1∶4 000)。

抗体致敏的鸡红细胞悬液:4%鸡红细胞悬液5 mL,加入同体积该凝集滴度的抗鸡红细胞抗体,混匀,于室温下作用 30 min,以 Hank′s液洗涤 2次,至悬于5 mL Hank′s液中备用。

猪外周血淋巴细胞的分离:取新鲜抗凝血1 mL,与Hank′s液1∶1混匀后,小心加于1 mL的细胞分离液之液面上,以1 500 r/min离心15 min,此时离心管中由上至下细胞分4层,第2层为环状乳白色淋巴细胞层,收集,洗2次即得所需淋巴细胞。

1.5 仪器 HMB-701型超微粉碎机,北京环亚天元机械技术有限公司;TGL-16C台式高速离心机;分析天平等。

1.6 中药超微粉制备 配方1:紫河车0.3 kg、炒苍术1 kg、麸炒白术1 kg、黄芪1 kg;配方2:牛胎盘0.3 kg、炒苍术1 kg、麸炒白术1 kg、黄芪 1 kg。将上述中药按比例配好,用一般粉碎机粉碎后过60目筛,再用超微粉碎机粉碎,铝箔袋包装备用。

1.7 外周血B淋巴细胞EA-玫瑰花环检测 取0.1 mL淋巴细胞,加致敏鸡红细胞0.1 mL混匀,室温下作用10 min,以1 000 r/min离心5 min,使细胞重悬浮,取一滴置玻片上,轻轻推开,干燥,瑞氏染色,高倍镜下计数200个淋巴细胞中玫瑰花环形成细胞百分数,凡淋巴细胞结合3个以上鸡红细胞者为EA-玫瑰花环形成细胞阳性。

1.8 外周血T淋巴细胞酯酶染色检测 吸取新鲜猪外周血中分离制备的淋巴细胞液一滴,滴于在玻片上,推成血片干燥,按照梁宏德等[2]介绍的方法染色、镜检、计数、数码照相。

2 结果

2.1 中药超微粉对断奶仔猪外周血B淋巴细胞EA-玫瑰花环形成的影响 经测定,中药超微粉对断奶仔猪外周血B淋巴细胞EA-玫瑰花环的形成是有影响的,超微粉Ⅰ组EA-玫瑰花环形成率为18.8±2.23、Ⅱ组B淋巴细胞EA-玫瑰花环形成率为18.2±1.32,均高于对照组(14.1±0.9),差异极显著。

2.2 中药超微粉对断奶仔猪外周血T淋巴细胞酯酶染色的影响 中药超微粉对断奶仔猪外周血T淋巴细胞酯酶染色的影响结果可以看出,超微粉Ⅰ组ANAE+率为39.95±2.51、Ⅱ组 T淋巴细胞ANAE+率为38.87±2.68,明显高于对照组31.35±2.08,差异极显著。

3 讨论

3.1 关于对断奶仔猪外周血B淋巴细胞EA-玫瑰花环形成的影响 B淋巴细胞表面没有红细胞受体,但具有免疫球蛋白Fc受体,以抗红细胞抗体(A)搭桥,将红细胞(E)连接于B细胞表面,形成EA-玫瑰花环。绵羊红细胞易与 T淋巴细胞形成E-玫瑰花环,易造成混淆,所以一般在检测B淋巴细胞时,采用鸡红细胞,从试验结果上看,此办法可行,试验组超微粉Ⅰ组和超微粉Ⅱ组明显高于对照组,但结合率普遍较低。此外,疾病的因素也影响花环的形成,柴方红等[3]研究发现,附红细胞体病仔猪的Ea花环率、EAC花环率均明显低于健康仔猪。

3.2 关于仔猪外周血ANAE T淋巴细胞变化 T淋巴细胞,即胸腺依赖淋巴细胞(thymus dependent lymphocyte),在胸腺内发育分化成熟,是淋巴细胞中数量最多功能最复杂的一类,参与细胞免疫。自1975年Mueller提出,酸性-醋酸萘酯酶(ANAE)是T淋巴细胞的特征,其在B淋巴细胞则为阴性后,国内外学者对ANAE的染色方法、应用范围及生物学性能进行了广泛深入的研究[2]。大量资料表明,一些中草药及复方制剂能够明显提高机体 T-淋巴细胞的数量,有助于免疫调节作用的发挥。戴远威等分别在雏鸡日粮中添加何首乌、补骨脂,结果试验鸡血液中T淋巴细胞百分率显著或极显著升高。王超英等将黄芪等10种天然药物加工成粉末,按20～30 g/kg添加到饲料中饲喂雏鸡,在用药后第3、5、7、10周检测T淋巴细胞 E花环形成率、B淋巴细胞花环形成率等,结果显示,大多数中药试验组上述指标值较对照组显著或极显著增加。胡庭俊等在使用禽霍乱疫苗进行免疫时,配合使用8301多糖肌肉注射试验鸡,结果与单用禽霍乱疫苗免疫鸡相比,多糖能显著提高鸡外周血淋巴细胞转化率,与正常淋巴转化率比较差异极显著,表明8301多糖能增强鸡的细胞免疫功能,提高禽霍乱疫苗免疫力。本试验表明,中药超微粉组仔猪外周血ANAE T淋巴细胞阳性率明显高于对照组,可能与所含黄芪有关。3.3 关于中药超微粉及其组方 超微粉碎技术是近年来国际上发展非常迅速的一项新技术,超细粉体是其最终产品,它具有一般颗粒所不具有的一些特殊的理化性质,如良好的溶解性、分散性、吸附性、化学反应活性等[4]。作为一门跨学科、跨行业的高新技术,超微粉碎技术在中药制药行业中的应用虽然起步较晚,但已显露出特有的优势和广阔的应用前景,这一技术的推广与应用必将推动中药的现代化。中药超微粉碎的特点:细胞破壁率高,有利于药物的释放和吸收;增加药物吸收率,提高其生物利用度;减少剂量,节省原料,提高效率,降低成本;有利于复方中药粉碎中各有效成分的均匀化,提高药物的作用效果;超微粉碎可在不同温度下进行,有利于保留生物活性成分,适用范围广;粉末分布均匀,服用口感好,易于成型,便于应用;污染小,产品卫生质量高,符合药品生产的GMP要求。

本试验用中药采用超微粉碎技术也体现了以上特点 。其配方 Ⅰ中 ,紫河车 :甘 、咸 、温,入心、肺、肾经,具有补肾益精,益气养血之功能,用于肾气(肾阳)不足,精血衰少,虚损嬴瘦之症。现代药理试验表明,可提高机体的免疫功能。炒苍术:辛、苦、温,入脾、胃经,具有燥湿健脾,祛风除湿之功。白术:甘、苦、温,入脾、胃经,补脾益气,燥湿利水,现代药理研究,对于化学疗法等引起的白细胞下降,有使白细胞升高的作用[5]。黄芪:甘、微温,入脾、肺经,具有补中益气、固表止汗、利水消肿,托疮排脓之功,临床试验表明,本品有提高抗病能力、强心、利尿、改善皮肤血液循环之功效,黄芪多糖具有促进胸腺发育、延缓胸腺萎缩、提高机体 T淋巴细胞数量、维持机体特异性与非特异性免疫功能的作用。诸药合用,补中益气、补益肝肾、清热解毒、利水消肿。配方Ⅱ中,牛胎盘主要成分有:丙种球蛋白、激素、酶及酶抑制因子、细胞因子、氨基酸、微量元素和维生素等[6]。房新平等[7]采用离子交换层析、凝胶层析和反相层析等生物分离技术,对牛胎盘中具有促进脾脏淋巴细胞增殖活性的成分进行了多步的纯化,得到了达到一定纯度的具有极显著的促进脾脏淋巴细胞增殖活性的成分。随着研究的深入,牛胎盘中提高机体免疫力的活性成分的理化性质,结构性能将会进一步得到鉴定,这将为牛胎盘中具有提高机体免疫力的活性成分的充分应用打下坚实的基础。从本试验结果上看,中药超微粉Ⅰ、Ⅱ组都能提高仔猪免疫力,但两组之间差异不显著,预示,在人胎盘(紫河车)紧张的情况下,可用牛胎盘代替。

[1]翟少钦,王天益,程安春,等.增免灵对鸭腺病毒蜂胶复合佐剂灭活疫苗的免疫增强作用[J].中国兽医杂志,2003,39(3):36-39.

[2]梁宏德,程相朝,宁长申.猪围产期外周血 ANAE+T细胞动态观察[J].畜牧兽医学报,2002,33(5):517-519.

[3]柴方红,贾立军,张守发.附红细胞体对仔猪Ea花环率和EAC花环率的影响[J].延边大学农学学报,2005,27(1):14-16.

[4]舒朝晖,刘根凡,马孟骅,等.中药超微粉碎之浅析[J].中国中药杂志,2004,29(9):823-829.

[5]刘钟杰,许剑琴.中兽医学[M].3版.北京:中国农业出版社,2006:7.

[6]陈迪,杨蓉生,钟金城,等.牦牛胎盘活性因子生物学效应的研究[J].西南民族大学学报:自然科学版,2005(增刊):126-131.

[7]房新平,夏文水,生庆海,等.牛胎盘提取物促进淋巴细胞增殖活性的研究[J].中国乳品工业,2006,34(10):41-44.