刘宝生 尚雅静 张日俊

随着畜牧业的不断发展，抗生素的超量使用给畜牧业带来的种种弊端日渐成为普通百姓关注的活题。致病菌中能耐受几乎所有抗生素的“超级细菌”的出现更成为桎梏畜牧业进一步发展的关键。全面停止抗生索在动物饲料中的添加，严格区分人、畜抗生素在疾病防治中的应用便成了全球人们的共同呼声。因而尽快寻找一种(类)能完全取代抗生素在畜牧业中作用的产品便成为广大科学工作者不断努力的方向。细菌素是一类由细菌分泌的通过在其他细菌的细胞膜上形成孔隙或影响细菌细胞内某些代谢过程的高效抗菌蛋白类物质，其作为一种长期存在于自然环境中的，具有天然抑(杀)菌能力的小分子蛋白类物质，目前已成为广大科学工作者研究和开发的焦点。在国外，这方面的研究自20世纪七八十年代就已开始，而国内有关细菌素用于动物疾病防治的研究报道尚未见公开发表。笔者仅就细菌素在动物疾病防治中的应用研究作一综述，为进一步加速我国对细菌素在动物疾病防治中的应用和研究提供科学依据。

1.细菌素的性质

细菌索是广泛存在于生活细菌周围的一类由核糖体合成的蛋白或多肽类物质，是细菌在生活中为了争夺营养物质和生存空间而分泌到周围环境中的、对其他细菌(尤其是具有近缘关系的细菌或菌株)具有抑制或杀灭作用的蛋白类物质，分泌菌自身对其具有免疫能力。细菌素与肽类抗生素的区别是前者是由基因编码、核糖体合成的一类胞外分泌蛋白，而后者则是细菌在生活过程中由多种酶类共同参与合成的蛋白类次级代谢产物(它没有自己的编码基因，也不是在核糖体内合成的)。细菌素与肽类抗生素的共同之处是两者都是蛋白类抗菌活性物质，都对各自的敏感菌具有强烈的抑制或杀灭作用。细菌素是细菌在生存竞争中的一种重要武器，自然界中99%的细菌都具有分泌一种或多种细菌素的能力。细菌素如此大规模的天然储备是细菌素全面取代抗生素的一个得天独厚的有利条件。

2.细菌素的生产与制备

细菌素的生产通常有2种方式：利用高产细菌素的天然菌株进行生产；利用工程菌株对细菌素的目的基因进行高效表达。前者产量通常较低，但所得细菌素的抗菌活性却非常稳定可靠，常用于实验室阶段的研究；后者利用成熟的基因工程表达系统将编码细菌素的目的基因进行高效表达，从而达到大规模生产细菌素的目的，是细菌素商品化的首选生产方式。但不管是天然菌还是工程菌发酵所生产的细菌素通常都是溶解在培养基中的混合物，还要经过盐析、超滤、层析等一系列的分离纯化才能获得相应的纯品或半纯品，有的还要进行干燥、包被或胶囊化后才能用于各种试验和生产实践中。

3.细菌素在动物疾病防治中的作用

3.1 细菌素抗动物致病菌的体外试验效果

大量的体外试验表明，细菌素对动物体内的各种致病菌都具有强烈的抑杀作用。细菌素的特征之一就是大多只对与分泌菌有近缘关系的菌株具有抑杀作用，利用这一特点，Etcheverria等在牛的结肠中分离到了能通过分泌细菌素来抑制大肠杆菌O157：H7的非致病性大肠杆菌，这对畜牧业中有效控制致病性大肠杆菌0157：H7的感染具有重要意义，同时也为控制动物的其他肠道致病菌提供了一个很好的思路。但最近越来越多的研究结果表明细菌素也具有广谱抑(杀)菌的能力，而且在抑杀致病菌方面与相应的抗生索具有同等效力。Xie等在长期的细菌素研究中分离到多株具有高产、广谱、高效抑(杀)菌能力的细菌素生产菌株。国外的研究也表明细菌素不仅对G+菌具有抑制作用，而且对G-菌也具有良好的抑制效果，在这些被抑杀的致病菌中既有好氧菌，也有厌氧菌。

体外试验结果还表明，细菌素不仅对普通的致病菌具有抑杀作用，更重要的是细菌素对那些已经对抗生素产生耐药性的致病菌依然表现出强烈的抑杀作用。Galvin等报道，广谱抗菌的细菌素Lacticin 3147对抗二甲氧基苄青霉素的金黄色葡萄球菌、抗万古霉索的粪肠球菌、抗青霉素的肺炎球菌都具有抑杀作用。细菌素对抗生素耐药性菌株的抑杀作用是基于其与抗生素完全不同的杀菌机理。事实上，细菌素最初之所以能被广大科技工作者重视的一个主要原因就是Nisin能有效抑制在低温环境下仍具有顽强生命力的致病性单胞李斯特氏菌。因此，细菌素对致病菌的抑杀作用一直以来都是对细菌素研究的一个核心。

3.2 细菌素在动物疾病防治中体表给药的试验效果

体外试验的绝佳效果推动了细菌素作为一种新型兽药用于动物疾病防治的尝试。对细菌素来说，在动物疾病防治中址直接的应用方式就是在动物的体表用药，其中研究最多的是细菌素在乳牛乳腺炎防治中的应用。Oliveira等的研究发现，分离自乳牛乳腺炎的65株致病菌全部都对由金黄色葡萄球菌质粒pRJ9产生的细菌素敏感。细菌素Lacticin 3147和Nisin的在体试验均表明细菌素可有效预防乳牛乳腺炎的发生而不会产生任何副作用。在人医上，利用细菌素来防治粉刺也取得了良好的试验效果。

3.3 口服细菌素对动物疾病防治的试验效果

口服给药是动物疾病防治中最常用的一种给药方式。但因为细菌素自身的蛋白质特性，细菌素的作用活性易受周围环境因素的影响，而且易被动物体内的某些酶部分降解。消化道中的内容物成分复杂，而且还含有大量能分解蛋白质的蛋白酶类，这使细菌素的消化道给药一直以来成为细菌素作为药用的一个难点。Gardiner等给断奶后5周的生长猪空腹饲喂200 ml。含Lacticin 3147为5000AU／mL的复活液和200g的开食料，饲喂后2h采集胃、空肠和回肠内容物检测Lacticin 3147的含量，结果表明，细菌素Lacticin 3147在动物采食后第2h在消化道各段内均无法检测到其活性的存在，质谱检测结果进一步表明胃肠道中并没有细菌

素Lacticin 3147的残存。同样的结果来自Bernbom等的研究，饲喂Nisin的小鼠经ELISA检测，其小肠食糜和粪便中 Nisin含量分别是其生物活性的10倍和200倍，这说明进入小鼠肠道内的Nisin很快就会在消化道内分解成碎片。由此看来，细菌素在进入动物的消化道后确实会被消化道内的消化酶部分或全部降解。此外，Gardiner等将Lacticin 3147与猪的粪便混合，发现细菌素的活力在0.5h内就下降了70%，到1h时只剩1.5%，这也说明肠道内的复杂环境(内容物的吸附作用、酶、微生物、pH等的影响)对细菌素的活性的确有很大的影响。

尽管细菌素在动物消化道内的作用会受到大量不利因素的影响，但仍有不少细菌素通过口服给药获得了良好效果的试验报道。Stern等通过人工感染的方法，使刚孵出的小鸡感染空肠弯曲菌，从第7d起，连续3d用经PVP包被的细菌素OR-7进行治疗，结果表明口服经微胶囊包被的细菌素可以极显著地降低家禽肠道内空肠弯曲菌的数量。Rea等通过模拟肠道环境，证明细菌素Lacticin 3147即使在18μg／ml。的低浓度下，仍然可以将动物肠道内高达1X106CFU／mL的顽固性痢疾梭菌完全清除。Corr等还通过试验证明了产细菌素的唾液乳杆菌进入小鼠胃肠道后，能有效防止单胞李斯特氏菌感染的是它分泌的细菌素Abpll8而不是乳杆菌本身，这也从另一个侧面证实了细菌素在动物肠道内仍可有效发挥其抗菌作用的功能。事实上细菌素对细菌的抑杀作用是非常迅速的，在一定条件下(如进行物理包被、化学修饰等)，细菌素完全可以在它被消化道内的酶降解之前完成其杀菌的作用。此外，最新的研究结果表明，细菌素还可以通过形成环状或某些特殊的氨基酸来增强抗动物胃肠道消化酶降解的能力。但细菌素作为一类分子质量较小的活性肽是否能够有效通过动物胃肠道粘膜上皮细胞而进入血液对动物体的系统感染起到预防和治疗作用至今尚未见报道。

3.4 高纯度细菌素腹腔和静脉注射的试验效果

Mota-Meira等的研究结果表明，腹腔注射的细菌素mutacin B-Ny266和万古霉素一样可以有效地治疗由金黄色葡萄球菌引起的小鼠腹腔感染，当对照组的死亡率高达70%～100%时，试验组无1例出现死亡。Ingham等通过静脉注射纯化的细菌素Piscicolin 126(P126)来治疗由静脉注射单胞李斯特氏菌引发的小鼠全身性感染，结果表明：细菌素P126在注射到小鼠体内后仍然保持抗单胞李斯特氏菌的活性，在李斯特氏菌感染的早期，静脉注射细菌素P126能明显减少李斯特氏菌在肝、脾的附着，减轻李斯特氏菌感染的临床症状。这些结果表明，高纯度的细菌素可以通过腹腔或静脉注射的方式用来控制和治疗动物体全身性细菌感染性疾病。大多情况下，细菌素注射后引起的副作用或溶血性反应主要是因为其中含有较多杂质的原因。研究表明，与真核抗菌肽magainin不同，高纯度的细菌素Nisin并不会引起人的红细胞产生溶血。此外，Reddy等的研究也表明，阴道内使用Nisin后，Nisin可以迅速透过阴道的粘膜上皮而进入血液中，进入血液中的Nisin可以在血液循环中被迅速清除，对动物自身的生长和生殖不会产生任何明显的影响。

3.5 细菌素的体外抗癌作用

体外试验表明，细菌素还具有抗癌的功效。在20世纪80年代，由于试验中所用的细菌素大多为粗提物，所以很少有关于细菌素具有抗癌性能的相关报道。随着高度纯化的细菌素的出现，越来越多的试验结果表明细菌素对多种癌细胞系具有拮抗作用。现已证明具有抗癌作用的细菌素有Vibriocin、Pyocin、Colicin、Pediocin和Microcin等。早在1976年Farkas-Himsley和Cheung就对包括Colicin在内的多种细菌素进行了试验，他们发现癌细胞对细菌素的敏感性要比普通细胞强，而且还发现动物的癌细胞要比人的癌细胞对细菌素更敏感。Abdi-Ali等的研究也表明细菌素PyocinS2只对癌细胞有抑制作用，而对正常的细胞不会产生抑制作用。虽然试验的结果显示细菌素对动物的癌细胞具有抑杀作用，但其作用的机理是否与抑杀细菌的作用机理一样，目前还不得而知。但有报道称Colicins E3和E5对癌细胞的抑制作用是引起癌细胞的坏死而不是引发细胞的凋亡，而对Microcin E492的研究表明，低浓度的Microcin E492即可引发Hela细胞的凋亡，而在高浓度时则可直接导致Hela细胞的坏死。

4.细菌素的抑(杀)菌机理

自从1925年比利时学者Gratia发现第一种细菌素——Colicin以来，据不完全统计，截至2007年6月已有近300种细菌素被分离纯化出来。这些细菌素中绝大部分都携带有一定量的净正电荷，且多肽链中75%以上都含有5～20个不等的疏水性氨基酸。这些净正电荷和由疏水性氨基酸构成的双亲特性正是大多数细菌素对细菌具有抑杀作用的重要结构基础。

大量的研究表明，细菌素对细菌的拮抗作用不 仅仅是抑制细菌的生长，同时也对细菌具有强烈的杀灭作用。当细菌素作用于目标菌株时，它可以由自身所带的正电荷与细菌细胞膜上所带的负电荷之间产生的静电吸附或细菌素与细菌细胞膜之间产生的疏水相互作用而向细菌靠近，并最终吸附在细菌的细胞膜上。在低剂量时，细菌素可以利用自身的双亲特性在细菌的细胞膜上形成跨膜的微小孔道。这些微孔足以让细菌细胞质内的各种小分子物质(如H+、K+及各种有机小分子)渗漏到细胞膜外，从而使细菌细胞内外的质子动力势(PMF)和电势差消失。细菌为了恢复原有的细胞内外的离子和电势的平衡，就会不断通过水解ATP的方式将泄漏到细胞外的离子和小分子物质重新运回细胞内，这样一来，细菌最终会因为ATP的耗尽而又无法恢复细胞内外的离子和电势的平衡而枯竭至死。当细菌素的浓度较大时，大量吸附在菌体细胞膜上的细菌素可以影响菌体细胞膜的性状，使细胞膜出现瞬时的缺口,吸附在菌体细胞膜上的细菌素即可通过这种瞬时的缺口进入细菌的细胞质内。这些进入细胞质内的细菌素即可影响细菌细胞内的多种代谢过程，如DNA的合成、RNA的转录、细胞壁的合成等等，从而发挥抑(杀)菌作用。同时，进入细胞质内的细菌素还可以进一步吸附在细菌细胞膜的内侧。细菌在细胞膜内外的细菌素的共同影响下，细胞膜出现较大的裂口，细胞内的物质(包括大分子有机物如ATP、核酸、蛋白质等)大量扩散到细胞外，从而导致细菌死亡，有的甚至可以导致整个细菌细胞裂解，细胞不复存在。

5.细菌素在动物疾病防治中的安全性评价

耐药性是所有抗菌性药物必然会遇到的一个问题，细菌素与抗生素一样也会有耐药性菌株的出现。但其出现的概率在1×10-9～1×10-8之间，比抗生素的概率要低得多。其原因是细菌素的作用机理与大多抗生素不同，细菌素对致病菌的杀灭作用是基于细菌素和致病菌自身的一些物理特性完成的，因此发生突变而产生耐药性的概率就变得非常低。但仍有不少研究结果表明，致病菌可以通过改变细胞膜的不饱和脂肪酸和(或)带正电荷氨基酸残基的含量及改变细胞膜磷脂的组成来改变细胞膜的结构，降低细胞表面负电荷的含量，对细菌素产生抗性。

药理、毒理的研究是细菌素用于动物疾病防治的必备资料，也是现今开发各种细菌索在动物疾病防治中的应用的一个关键性任务，但直到目前，有关这方面的报道非常少。Drewa等通过在培养基中加入细菌索Staphylococcin T的方法研究了细菌素对哺乳动物成纤维细胞的影响，结果表明，使用细菌索后成纤维细胞的形态没有产生明显的变化。为了进一步开发Nisi在妇女生殖健康及避孕上的应用，Reddy等在家兔和小鼠上进行了一系列急性毒性和慢性毒性试验，所有的结果都一致表明Nisin的使用不会对动物本身及其后代产生任何不良影响。

总之，细菌素是细菌自身产生的对其他细菌或菌株具有抑杀作用的一类蛋白类物质，它对对各种致病菌都具有很强的抑杀活性，在动物体内使用后通常很难产生耐药性，也不会有任何的残留，是目前各类抗菌物质中有望完全取代抗生索并在畜牧业中应用的一类理想替代品。随着对细菌素在动物疾病防治中应用研究的不断深入，有理由相信细菌素必将为今后畜牧业的可持续发展发挥巨大的作用。