王慧慧 时 坤 于本峰 刁 燕 杜 锐

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)是黄病毒科，瘟病毒属的成员，可引起多种动物呈多临床表现的病毒性腹泻-粘膜病，主要表现为腹泻，急、慢性粘膜病，母畜流产、不孕，产死胎、木乃伊胎或畸形胎等。自1946年Olafson等首次报道牛病毒性腹泻-粘膜病以来，该病呈世界性分布，广泛存在于美国、澳大利亚、英国、新西兰等畜牧业发达国家。我国目前已有20多个省市自治区存在该病，给养殖业带来了巨大的经济损失。国际兽疫局(OIE)将其定为B类传染病，我国在进出口检疫中也把它定为二类传染病。国外对该病主要采取疫苗接种和淘汰持续感染病畜的综合防治措施。国内对BVDV疫苗的研究相对滞后，目前国内还没有正式的国产BVDV疫苗。因此，研制一种安全有效的BVDV疫苗是当前防治该病的主要方向。

1.常规疫苗

在疫苗发展全盛时期的60年代研制了第一批BVDV疫苗，这是一种相对简单的全毒疫苗，事实上它与现在常规应用的BVDV疫苗并没有多大差异。目前，商品化BVDV疫苗主要是利用一些常规的BVDV研究毒株，如NADL株、Singer株、Oregon C24V株和NY-1株等细胞培养物而产生的弱毒或灭活苗。一般来说，这两种疫苗对同源毒株或抗原差异较小的毒株的保护是有效的，但对于感染了不同抗原性BVDV毒株的畜群来说，使用这类疫苗就得不到有效的保护。Makoschey等对1型BVDV(Bloviklis BVD)灭活苗用于临床2型BVDV感染的免疫效果进行了研究，结果表明：Bloviklis BVD灭活苗只能够给异源的2型BVDV感染提供一定的交叉保护。

1.1 弱毒苗

弱毒疫苗存在一个安全性的问题。专家们已有共识，弱毒苗比死苗或灭活苗的危险性更大，因为弱毒苗需要考虑其恢复致病性的潜力。弱化病毒是子宫感染和免疫抑制的一个潜在因素，已证实有些粘膜病的发生和牛群免疫BVD弱毒疫苗有关，这种危险性在某种程度上已取代了它的优点。其次，有的专家认为，BVD活疫苗免疫母畜后可能不出现临床症状，但少量的BVDV却能引起胎儿损伤，或持续感染。因此，一般要求对怀孕牛避免使用弱毒苗。另外，这些疫苗是用牛源细胞培养物制备的，因此有可能将其他的生物介质作为污染源带入动物体内。

当然，活疫苗还是有一定的免疫保护作用，因此国内外也有学者不断尝试改进活疫苗的质量，以期发挥其应有的免疫效力。20世纪80年代初(中国兽药监察所)有人用Oregon C24V标准毒株试制了BVD弱毒冻干苗，试用后虽能产生抗BVD感染的保护性中和抗体，但注射疫苗后发现有白细胞数减少，一过性热反应等现象，故最终未申请投入批量生产。阎高峰等试制了BVD O系弱毒冻干苗，并在青海省玉树、称多和则库3个疫病发生严重的县试用，证明对预防BVD有较好的效果，但也因成本和其他原因未能申请批量生产。

1.2 猪瘟兔化弱毒苗

猪瘟兔化弱毒苗对预防BVD也有一定的作用。20世纪80年代初，首次证明了牦牛粘膜病的存在之后，曾用注射猪瘟弱毒苗来预防牦牛粘膜病。共注射270头牦牛，注苗半年后测定血清中和抗体效价与粘膜病弱毒苗效价相近，且发现牦牛群中流行的粘 膜病得到了良好控制。冯彦昌用猪瘟兔化弱毒苗免疫牛，经过4年的应用证明取得了良好的预防效果。纪金春等用猪瘟兔化弱毒苗对青海省某地4万多头牦牛进行免疫接种，结果未免疫猪瘟苗的牦牛群死亡率达3.28%，而免疫的牦牛群死亡率为0.27%，两组差异显著。可见用猪瘟弱毒苗预防牛病毒性腹泻病有一定的效果，可以作为预防BVD的措施之一。但国内使用的猪瘟疫苗是弱毒，接种于牛体后是否会发生抗原变异有待研究，在尚未获得确切的依据之前，应慎用。

1.3 灭活苗

灭活苗的安全性较弱毒苗有很大优势，因此，国内外对不同灭活方法的研究十分活跃。已经证实，用福尔马林灭活的BVDV灭活苗在一定程度上对胎儿具有保护力。Roeder P L等用氮丙啶(Aziridine)灭活的疫苗应用到牛体后，未见感染等不良反应。我国学者应用二乙烯亚氨灭活氢氧化铝作为灭活苗的佐剂，也证明对胎儿具有一定保护力。

但是由于灭活苗免疫原性较差，很多学者对它在胎儿保护的有效性方面存在质疑，而且正如上文所提及的，灭活苗与弱毒苗一样，对抗原性不同的BVDV的交叉反应性较弱。因此，研究者们仍需深入研究，选择出免疫原性好、抗原谱广的毒株作为制苗种毒，以提，高疫苗的免疫效果。

1.4 联合疫苗

有报道表明，灭活苗联合弱毒苗应用可提高免疫接种的效果。德国Frey等对8只母牛用BVD活苗免疫接种4周之后，再将这些母牛在交配期内接种一或两次灭活疫苗，两次接种间隔4周，在母牛妊娠60～80 d内用强毒株攻击，并进行病毒分离和抗体检测，结果表明，新生小牛在病毒分离和抗体检测方面均为阴性，说明后代没有感染BVDV，从而证实使用灭活苗有利于提高BVD活苗免疫接种的安全性。这样联合使用，一方面可提高灭活疫—苗的免疫效力，另一方面可提高弱毒疫苗的安全性，因此，灭活苗和弱毒苗联合使用也是免疫预防该病的有效途径之一。

2.新型疫苗

鉴于传统疫苗存在诸多不足，促使人们寻求一种更加安全有效的BVDV疫苗。目前国外很多学者已经从多种途径进行BVDV新型疫苗的研制，这其中包括重组活载体疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗，以及含多种抗原的传统疫苗。

2.1 亚单位疫苗

分子生物学技术的发展和应用，为研制和生产BVDV亚单位疫苗提供了广阔的前景。如利用BVDV糖蛋白E2(gp53)研制成的E2亚单位疫苗，其机理是将编码E2基因的质粒DNA直接注入动物体内，在机体内翻译表达，产生中和抗体，从而对动物具有良好的保护作用。近年来，国外许多学者进行了E2亚单位疫苗的研究。丹麦在ISCOM技术的基础上研制出新的牛病毒性腹泻亚单位疫苗。该BVD亚单位疫苗能产生高水平的中和抗体，不仅能抵抗同源毒株的感染，而对丹麦的野外分离株的感染也有保护作用。另外，该苗比一般亚单位疫苗的生产工艺简单，不需要精密仪器，易于推广应用。Bruschke等针对4种抗原性不同的毒株，构建了多价的E2亚单位疫苗，属于Ia、Ib和基因Ⅱ型，该疫苗对同源毒株能提供部分保护。Wang等证明了融合C3d的E2亚单位疫苗有提高疫苗免疫效果的潜在能力。

2.2 DNA疫苗

DNA疫苗因其具有诸多优点而被认为是疫苗研究领域里的新纪元。BVDVE2DNA疫苗是近年来BVDV免疫研究的热点。Nobiron等进行了E2DNA疫苗和使用IL-2；GMCSF作为免疫佐剂的E2DNA疫苗免疫效力的研究，结果所有小鼠免疫后都产生了较强的体液免疫应答和细胞免疫应答，其中使用细胞因子作为佐剂能加强免疫应答。Harpin等通过对小鼠肌肉或皮内注射含有BVDVE2基因的质粒后，产生的中和抗体能持续6个月。Harpin等将E2DNA裸体疫苗(N-DNA)和脂质体包裹的疫苗(L-DNA)分别注射牛，两组都产生针对疫苗的中和抗体，N-DNA组免疫反应较弱，16周后用BVDV-I株攻毒，N-DNA具一定保护作用，L-DNA则没有。攻毒后可激发免疫牛产生针对BVDV-I和BVDV-Ⅱ中和抗体。Nobiron等就E2 DNA疫苗对牛的免疫效力试验，免疫组15头牛攻毒后，13头可以检测到中和抗体，其中8头牛白细胞中能分离到病毒，而对照组全部可以分离到病毒，表明E2DNA疫苗对牛有一定的保护力。这些都证明了DNA疫苗具有很大的开发潜力和应用前景。

此外，BVDV全长的感染性克隆已经构建成功，这使研究者们可以通过反向遗传技术来研制致弱的BVDV毒株，最终将研制出一种安全高效的减毒活疫苗。BVDV非翻译区5’-UTR缺失，可用做BVDV弱毒活疫苗，接种免疫后可以产生高水平的BVDV中和抗体，保护动物不受同源毒株的攻击，而且安全有效。国外还有学者进行了BVD可食用疫苗的研究，这也是一个值得探索的方向。

2.3 重组活载体疫苗

利用基因操作技术将BVDV E2基因插入到另一种病毒基因组中，使之高效表达重组蛋白的重组病毒已经构建成功，使用的载体包括水疱性口炎病毒、牛I型疱疹病毒、禽痘病毒、牛3型腺病毒。Grigera等将E2基因克隆到水疱性口炎病毒中，重组病毒免疫小鼠后能显著减少病毒感染症状，所产生的中和抗体在体内能持续180 d。Kweon等将BVDV E2基因插入到牛疱疹病毒TK基因上，用重组病毒免疫牛后，产生的中和抗体能显著减弱临床症状的发生。Liang等报道，去掉E2蛋白的跨膜锚定区并导入牛疱疹病毒(BHV-1)的信号序列，可使E2蛋白大量表达，免疫小鼠后在其体内能检测到大量的IgG抗体。这一发现为BVDV基因疫苗的研制奠定了基础。

最近有报道，可将穿梭表达载体pMV261-E2转化到卡介苗中，获得重组卡介苗，说明牛病毒性腹泻—粘膜病病毒E2基因可以成功地在卡介苗中表达。由于卡介苗(BCG)是预防结核病的有效制剂，集佐剂与抗原于一身。作为重组细菌活载体的rBCG比重组病毒活载体更容易开发，如生产工艺简单、价廉，不需纯化及后期处理，性质稳定易保存，可口服和注射两用。因此，这是研制BVDV新型疫苗的一个新的探索方向。

3.小结

BVDV毒株变异性较高，防制工作困难较多，而我们使用BVDV疫苗已有30多年的历史，常规疫苗中无论是弱毒苗还是灭活苗，没有一个是绝对安全有效的。所以要从根本上解决防制问题，还需从分子生物学方面着手，研制BVD新型疫苗。从目前国内外学者研究情况来看，新型疫苗在使用效果、安全性等方面都要优于常规疫苗。

综上所述，目前还没有一种较理想的常规疫苗，新型疫苗也还存在许多问题有待解决，因此，牛病毒性腹泻疫苗仍有广阔的研究空间。这就迫切需要国内外学者进行进一步的研究，优化传统的常规疫苗，探索新型疫苗。而据近年来相关的文献报道表明，重组活载体疫苗由于其高效而具有高度特异性的优点，已经成为研制BVDV新型疫苗的一个热点趋向。相信随着预防兽医学、动物免疫学及分子生物学的不断发展，在不久的将来，人们能够研制出一种高效、安全、廉价的牛病毒性腹泻疫苗，最终达到控制甚至消灭牛病毒性腹泻的目标。