闫继东

(河北省唐山市工人医院胸外科 河北唐山 063000)

1 Smad4的发现和鉴定

人类第18号染色体长臂区域上的等位基因杂合性缺失是多种肿瘤的频发事件，迄今在这一区域已经发现和鉴定了多个肿瘤抑制基因，如DCC、MADR2/JV18-1、DPC4(Smad4)等。其中Smad4蛋白是TGF-β信号传递途径的必需物质，处于中枢地位。1995年，有学者在研究黑腹果蝇Dpp体内信号的转导时，发现DppI型受体细胞内信号的下游分子，并克隆其基因，这个基因被命名为Mad，随后有学者克隆出Mad相关基因sma2、sma3、sma4，并认为其为mad同源物，在体内可以形成复合物并协同发挥作用。后来人们将各种mad相关蛋白统一命名为Smad，因此这类蛋白统称为Smads蛋白。当前包括Smad1-9，它们都存在于细胞质中，作用是将TGF-β/Smads信号转导入核内并参与TGF-β靶基因的调节。

Smad4作为Smads蛋白家族的重要成员，其基因定位于染色体18q21.1，含有11个外显子，10个内含子，其核苷酸序列保存在GenBank的U44378中，基因的转录子长2680bp，是编码552个氨基酸残基组成的蛋白质。Smad4蛋白是通过研究多重终止密码子和启动子拼接位点而确定的。Smad4的一级结构分为3个区:N端区、C端区和中间连接区。N端区和C端区与其他动物的MAD蛋白高度同源，因此也称MH1和MH2，中间连接区富含脯氨酸。Smad4与其它的Smad不同，其MH2没有磷酸化结构SSXS，单独存在不足以行使信号传导功能，必须有部分中间连接区才能传递信号，这部分称为Smad4的活性区。Smad4被认为是通用调节分子，因为它几乎能与所有活化的受体调节型Smads蛋白结合，并形成低聚体复合物，参与信号转导。

2 Smad4蛋白的功能及作用机理

Smad4蛋白与TGF-β密切相关，是TGF-β受体信号传导途径的重要成员。TGF-β是一种多功能多肽，在组织的发育、再生及修复中起重要作用;TGF-β还是一种具有多功能活性的细胞因子，其可以调节细胞增殖、分化和凋亡，对多种细胞因子有重要影响。TGF-β有两型受体，每一型均含有细胞内有丝氨酸/苏氨酸激酶区。TGF-β细胞因子信号传导通过TGF-β I型、II型受体完成，这两种受体都有一跨膜片断，外端暴露于细胞外，内端插在胞浆中。它们也是丝氨酸/苏氨酸激酶，通过活化受体的磷酸化，从而使受体调节型Smad也活化。活化的受体调节型Smad协同Smad将受体信号传到核内。许多Smad基因都介导了TGF-β超家族的功能，包括骨形成蛋白、活化素和TGF-β。Smad4在肿瘤中发病中，常常突变，突变类型以点突变为主，还可以有错义突变、无义突变、移码突变等，突变后的Smad4蛋白构象发生改变，不能与磷酸化的Smad2和Smad3结合，从而不能发挥调控转录的作用。Smad4的MH1域突变并不影响其本身的活性，但突变型的Smad4比野生型的更容易被激活泛素连接酶降解。磷酸化的TGF-β被激活后，可活化Smads蛋白，主要是Smad4，进而调节靶基因的转录，控制肿瘤细胞生长、分化及凋亡。此通路受细胞因子调节，其任何一个元件失调，均可引起细胞增生，而在肿瘤细胞形成过程中可引起分化异常，进而引起异常肿瘤性增生。体内细胞分泌的TGF-β主要通过调控核内CKI(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子)的表达，阻止细胞周期运行，抑制细胞向恶性转化。在信号传导过程中，活化的TGF-β1与其膜返体结合后形成两种异二聚体复合物，继而磷酸化下游的Smad2，Smad3蛋白，磷酸化后的Smad2和Smad3可与Smad4形成异源复合物，由胞浆移位至胞核，调节靶基因的转录。有观点认为Smads家族的基它成员也参与到此通路中，并形成正反馈与负反馈的平衡，共同调节肿瘤的进展。但是有观点认为TGF-β在肿瘤的发生、发展中是一把“双刃剑”，即在癌变期之初作为抑癌因子出现，而在癌症晚期则通过自分泌(作用于癌细胞本身)和旁分泌(作用于癌细胞周围的微环境)方式刺激肿瘤浸润、转移，因此，Smads与TGF-β的通路作用可能更为复杂。

3 Smad4在肿瘤中的作用

Smad4研究最多是在胰腺组织中，Smad4在胰腺癌组织中的表达明显低于正常组织，同时相关研究表明胰腺癌中Smad4/TGF-β通路与PTEN和NF-kappaB调节有关。还有观点认为胰腺癌中SCF(beta-TrCP1)对Smad4蛋白有重要的调节作用。范振斌等通过对30例移行细胞癌新鲜癌组织进行分析和精细遗传作图，并用DPC4/Smad4抗体对相应的病理组织切进行免疫组织化学分析，结果显示DPC4/Smad4三个紧密联锁的微卫星位点D18S46、D18S363、D18S474有高频率的杂合性缺失，18个微卫星位点中有5个点在所分析人群中多态性甚低，与西方人数据差别明显;且免疫组化显示DPC4/Smad4在80%的肿瘤中表达下降或不表达，与微卫星杂合性缺失对应良好，并认为抑癌基因DPC4/Smad4的失活在中国人膀胱移行细胞癌的发生发展中具有一定作用，其等位基因的杂合性缺失是该基因失活的重要机制。有观点认为当RSmad被I型受体磷酸化，从而导致与CO-Smad Smad4结合，复合体进入核内启动转录，一旦进入细胞核，Smad复合体与其他转录共刺激信号组成共抑制分子，共同控制靶基因的表达，因此伴随着Wnt信号系统异常调节，或者由于Wnt基因的异常表达，破坏了正常的Wnt/B-catenin、Notch、BMP的信号系统，导致肿瘤细胞可自分泌大量的TGF-β1，磷酸化R-Smad，从而导致与CO-Smad Smad4结合，Smad4的减少，使细胞对TGF-β1的生长抑制产生耐受，促进肿瘤的发展。伴随着Notch信号途径的异常表达，引起下游级联信号系统TGF-β超家族在内的细胞信号传导的异常，Smad4作为TGF-β1信号传导系统的关键组成元件，对其信号转导具有着关键作用。其缺失或突变可使细胞对TGF-β1的生长抑制产生耐受，促进肿瘤的发展。体外细胞培养的实验也证实了此观点。有研究结果显示Smad4与CyclinD1在膀胱癌中具有正相关性，且随着肿瘤恶性程度的增高，二者的表达率均下降，认为Smad4与CyclinD1的表达与自然病程密切相关，其表达变化是肿瘤进展的表现。张磊等通过应用免疫组织化学技术检测多Smad4、CyclinD1、Survivin和Cox-2在44例大肠癌组织中的表达，认为其联合检测对了解大肠癌的发生、发展、指导治疗和判断预后有重要意义，Smad4可作为一个独立预测指标判断大肠癌的预后。SELIL与Smad4蛋白在食管癌中具有协同作用，SELIL在食管癌中的作用可能通过TGF-β信号途径影响基因的表达而调控细胞的生长。吴鹏等通过应用RNA干扰技术下调Smad4基因表达，观察其对宫颈癌细胞增殖的影响，认为其能筛选出特异而高效阻断Smad4基因表达功能的shRNA，Smad4基因表达下调能明显促进宫颈癌细胞生长。Blackford等认为Smad4基因突变与胰腺癌的预后密切相关。Kloth等通过免疫组织化学技术对117例原发性宫颈癌患者的Smad4进行检测，显示肿瘤中Smad4低表达，并认为细胞浆中Smad4的弱表达和细胞核中表达的缺失与宫颈癌的不良预后密切相关。因此，Smad4在不同肿瘤中的表达均有变化，提示Smad4参与了肿瘤的发生发展。

4 Smad4在肺癌中的作用

有学者在1998年对肺癌组织及体外培养的细胞株中相关的Smad4/TGF-β基因进行分析，认为Smad4/TGF-β参与了肿瘤的发生。Gemma等通过Northern blot、RT-PCR等技术对肺癌细胞系TGF-β的表达进行分析，认为TGF-β可以调节MMP-2、PAI-1、IL-1及CEA等多种细胞因子，在肺癌的发生中具有至关重要的作用。Ke等认为Smad4通过不同的机制影响肿瘤的血管生成，并通过应用免疫组织化学技术检测肺癌中DPC4/Smad4与血管生成的关系，结果显示DPC4/Smad4能降低肿瘤组织中VEGF蛋白和mRNA的表达，增加TSP1蛋白和mRNA的表达，确认DPC4/Smad4是一个重要的生物学指标，并在肿瘤转移及血管生成中发挥重要作用。Filyak等认为Smad2、Smad3、Smad4蛋白下调，而Smad7上调对人肺癌A549细胞系的发生发展有重要作用。Finger等认为TGF-βRIII作为一个新的肿瘤抑制基因在肺癌细胞系中普遍丢失，其表达可能与肿瘤的浸润等生物学行为有关。因此，关于Smad4/TGF-β在肺癌及肺组织中表达，主要研究在体外培养的细胞系中，而对肺癌组织中蛋白的表达及mRNA的表达关注较少。

5 临床意义和展望

目前关于Smad4在肿瘤中的研究是人们关注的热点，其可以作为预测肿瘤预后的重要指标，因此，临床可以借助相关的辅助方法来判断患者预后。但是由于TGF-β超家族成员庞大，受体配体间组合作用多样化，个体成员在不同肿瘤中发挥作用也不尽相同，因此对于其真正的作用机制及干扰因素，临床及基础研究中并不十分清楚，对其机理及影响因素的研究将是当前研究的重要方向。同时构建合格的人类肿瘤动物模型，进行阻断Smad4/TGF-β通路的研究，有望成为肿瘤研究及治疗的靶点，可以为肿瘤的治疗提供新的思路。由于Smad4/TGF-β为肿瘤研究的新领域，与其它研究一样，还有哪些基因可以诱导其强表达或弱表达？动物实验中对Smad4/TGF-β的干扰能否直接用于临床？Smads家族的其它成员，如Smad1、Smad2、Smad3、Smad7与Smad4/TGF-β是否具有相互作用？等等。相信随着这些问题广泛而深入的研究，对于抗肿瘤通路的研究及治疗将开辟新的途径。

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